[发明专利]用于测定神经毒素多肽的量及其催化活性和蛋白酶解活性的手段和方法

说明书

技术领域

本发明属于用于确保多肽生产和质量控制的工具领域。具体来说，本发明涉及在含有已加工好的神经毒素多肽和部分加工的或未加工的神经毒素多肽的溶液中确定加工好的(活性)神经毒素多肽的量的方法。本发明还涉及用于测定所述量的装置以及适用于实施本发明方法的试剂盒。

背景技术

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生强效的神经毒素，即分别为肉毒杆菌毒素(BoNTs)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNTs)特异地和神经元细胞结合并破坏神经递质的释放。每种毒素合成为无活性的、未加工的约150kDa的单链蛋白质。翻译后的加工包括二硫键的形成、以及由细菌蛋白酶进行的有限的蛋白酶解(切割)。活性神经毒素由通过二硫键相连的两条链组成，一条约50kDa的N-端轻链和一条约100kDa的重链。CNTs在结构上和功能上由3个结构域组成，即具有催化功能的轻链、包含移位结构域(translocation)(N-端的半部分)和受体结合结构域(C-端的半部分)的重链，见Krieglstein1990，Eur J Biochem 188，39；Krieglstein 1991，Eur J Biochem 202，41；Krieglstein 1994，J Protein Chem 13，49。肉毒杆菌毒素被合成为包含150kDa神经毒素蛋白和相关非毒性蛋白的分子复合物。复合物的大小根据梭菌的菌株和独特的神经毒素血清型而不同，在300kDa、大于500kDa和900kDa之间变化。这些复合物中的非毒性蛋白具有稳定神经毒素、保护其不被降解的作用，见Silberstein 2004，Pain Practice 4，S19-S26。

肉毒梭菌分泌7种抗原性上独特的肉毒杆菌毒素(BoNT)血清型，称为血清型A至G。所有这些血清型与破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(TeNT)一起是Zn2+内切蛋白酶，它们通过切割SNARE蛋白来阻断突触的胞吐，见Couesnon，2006，Microbiology，152，759。CNTs导致见于肉毒中毒和破伤风的弛缓性肌肉瘫痪，见Fischer 2007，PNAS 104，10447。

尽管具有毒性效应，肉毒杆菌毒素复合物已被用作许多疾病的治疗剂。肉毒杆菌毒素血清型A于1989年在美国被批准人用以治疗斜视、睑痉挛以及其它疾病。它在商业上以肉毒杆菌毒素A蛋白制剂获取，例如，在商业名BOTOX(Allergan公司)或商业名DYSPORT(Ipsen公司)下。一种改进的、无复合的肉毒杆菌毒素A制剂可以以商业名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)商业获得。作为治疗用途，该制剂被直接注射到需要治疗的肌肉中。在生理pH值时，该毒素从蛋白质复合物中被释放出来并产生期望的药理学效应。肉毒杆菌毒素的效应只是短暂的，这正是为什么可能需要反复施用肉毒杆菌毒素以维持治疗效果的原因。

梭菌神经毒素减弱随意肌的强度，是对斜视、局灶性肌张力障碍，包括颈部张力障碍、和良性特发性睑痉挛有效的疗法。它们还已经被证实可以缓解半面痉挛和局灶性强直，此外，在例如胃肠道病症、多汗症以及美容抗皱修复等其它广泛的适应症中有效，见Jost 2007，Drugs 67，669。

在梭菌神经毒素的生产过程中，活性神经毒素多肽的定性和定量确定及其质量控制非常重要。目前可获得的神经毒素制剂除了包含所需要的活性(已加工好的或成熟的)神经毒素之外，还包含未经蛋白酶解加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽。未经蛋白酶解加工的前体或部分加工的神经毒素多肽和成熟的(活性的、已加工好的)神经毒素多肽在序列上只有少数几个氨基酸的差异。因此，很难根据它们的化学和物理特性将其定量地区分开来。另一方面，在这类制剂中，未经蛋白酶解加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽在总蛋白中所占的部分可能仍然显著。该部分取决于用于生产的生物系统，并是发酵过程中的生物合成和反应条件的结果。因此，在神经毒素制剂中所需要的成熟、具有生物活性的神经毒素多肽的含量是预先规定的，并且目前非常难以确定。

迫切需要用于成熟(活性)神经毒素多肽的可靠定性和定量检测系统的工具和方法，这些工具和方法目前还不可获得。

因此，本发明的技术问题可以看做提供满足上述需要的工具和方法。该技术问题通过在权利要求和下文中描述的实施方案得到了解决。

发明内容