[发明专利]包含腺伴随病毒构建体的靶向传导气道细胞组合物

说明书

关于联邦资助的研究或开发的声明

本工作中部分是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助下进行(P01-HL051746)。美国政府可享有本发明的某些权利。

发明背景

腺伴随病毒(AAV)是细小病毒(Parvovirus)家族的成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4.7千碱基(kb)到6kb的单链线性DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现的，所以AAV指定为依赖病毒属(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV基因组在感染后整合入宿主基因组)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的AAV基因组随之得到解救、复制并包装入感染的病毒)。非致病性，广泛的宿主感染范围，含有非分裂细胞和整合性的特点使AAV成为具有吸引力的输送载体。

AAV衣壳含有三个病毒蛋白(VP)VP1、VP2和VP3的60个拷贝(总共)，预测比例为1∶1∶10，以T＝1排列的二十面对称体。[H-J Nam等，J Virol.，81(22)：12260-12271(2007年11月)]。这三个VP蛋白由同一mRNA翻译，VP1除了C末端含有完整VP2序列外，还包括独特的N末端结构域[Nam等，如前引用]。VP2除了其C末端的VP3外，还包括额外的N末端序列。在AAV2[Q.Xie等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 99：10405-10410(2002)]和AAV4[L.Govindasamy等，J.Virol.，80：11556-11570]衣壳的X射线晶体结构和所有其它已确定的细小病毒衣壳的结构中，仅观察到AAV衣壳蛋白(约530个氨基酸)内的C末端多肽序列。VP1的N末端独特区域，VP1和VP2的重叠区和VP3的前14-16个N末端残基是杂乱的[L.Govindasamy等，和Q.Xie等，如前引用]。冷冻电子显微镜和图像重构数据说明在完整的AAV衣壳中，VP1和VP2蛋白的N末端区域序列定位在衣壳内[E.Padron等，J.Virol.79：5047-5058(2005)；Q.Xie等，如上引用]，受体和抗体都无法接近结合该区域[S.Kronenberg等，J.Virol.，79：5296-5303(2005)]。因此，认为受体连接和转导表型由VP1-VP3的常见C末端结构域内的氨基酸序列决定[Nam等，如上引用]。除了包含靶向细胞核的核定位序列，已证明VP1独特区域包含功能性的磷脂酶A2，该酶为受体连接后通往细胞核期间内涵体逃逸所需[JC Grieger等，J.Virol.80：5199-5210(2006)；F.，Sonntag等，J.Virol.，80：11040-11054(2006)]。

许多年以来，本领域仅已知6个不同序列的AAV，大部分作为腺病毒制备培养中的污染物分离得到。最近，研究者描述了获自组织的大量不同序列的AAV[G.Gao等，Proc Natl Acad Sci USA，100(10)：6081-6086(2003年5月13日)；US-2003-0138772-A1(2003年7月24日)]，并且将这些AAV表征为不同的血清型和分化体[G.Gao等，J.Virol.，78(12)：6381-6388(2004年6月)；国际专利公开号WO 2005/033321]。已报道不同的AAV表现出不同的转染效率，也表现出对不同细胞或组织的趋向性。