[发明专利]对生物学样品中的物质进行检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及对生物学样品中的物质定性和/或定量地进行检测的方法。通过本发明的方法，针对尤其是在生物学样品中微量存在、通常难以检测的物质也能够进行检测。

背景技术

利用通过疏水结合、共价结合等而结合有与被检测物质特异性结合的蛋白质的担载体的物质检测方法

为了对生物学样品中的物质进行检测，以往广泛使用利用针对该物质(被检测物质)特异性结合的物质的方法。作为与被检测物质特异地结合的物质，多数情况下使用抗体、其它蛋白质等。上述这些物质可以固定化在微孔板、微珠、或传感器芯片等担载体上。作为固定化的通常的方法，已知有疏水结合、共价结合等。

“疏水结合”是利用担载体的疏水性表面，和与待检测物质特异性结合的蛋白质(以下，有时也称为“特异的蛋白质”)的疏水性部分之间的相互作用，使担载体与特异的蛋白质结合，不需要特别的试剂、简便。但是，通常结合力较弱，在用于ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)等时，通过结合后的清洗操作等，蛋白质从担载体上脱离的情况较多。此外，通过疏水结合使特异的蛋白质与担载体结合时，有时多数蛋白质会完全丧失其功能或部分地丧失其功能。

“共价结合”是利用特异的蛋白质中的官能团(例如氨基)与设置在担载体表面的官能团(例如羧基)之间的相互作用，结合力较强。但是，通过共价结合使特异的蛋白质与担载体结合时，与疏水结合的情况同样，在多数的蛋白质中，其功能完全或部分丧失。

除了疏水结合和共价结合之外，还已知有如下方法：使多个组氨酸融合在蛋白质的末端，具有该组氨酸标签的融合蛋白与表面设置有镍的例如蛋白质芯片等基板等进行结合的方法。但是，组氨酸标签与镍离子之间的相互作用不太强，此外，还已知镍离子与各种各样的生物体分子之间存在非特异性结合。

通常来说，在特异性结合分析体系中，降低作为背景信号的原因的非特异性结合是重要的课题，上述分析体系使用如上这样通过疏水结合或共价结合而结合有与被检测物质特异性结合的蛋白质的固相。作为解决该课题的方法，提出了如下方法：例如，使细菌成分提取液包含在检测用试剂中的方法(日本特开昭59-99257)；将下述宿主细胞的培养成分添加到样品中的方法，其中，该宿主细胞是导入有与用于生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的载体(vector)同种的、且不含编码该蛋白质的基因的载体的宿主细胞(日本特开平8-43392)；对来自和生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的细胞相同种、且不含该蛋白质的细胞的水提取液进行加热处理后，将其水溶性级分添加到样品中的方法(日本特开2004-301646)等。通过这些方法，可以观察到对抑制非特异性结合具有的一定效果。

利用抗生物素蛋白-生物素结合的物质检测方法

抗生物素蛋白是来源于蛋清的糖蛋白，与生物素(维生素H)的结合非常强。抗生物素蛋白与生物素的相互作用是最强的非共价结合中的一种(Green(1975)Adv Protein Chem 29：85-133)。另一方面，链霉抗生物素是来源于放线菌的类抗生物素蛋白的蛋白质，与生物素的结合也较强。到目前为止，就(链霉)抗生物素蛋白-生物素的相互作用而言，由于其作用力的强度，因此被广泛用于例如抗原和抗体的检测等分子生物学、生物化学领域(Green(1990)Methods Enzymol 184：51-67)。

有人提出了利用该抗生物素蛋白、链霉抗生物素的生物素结合性，使蛋白质与担载体结合的方法。即通过共价结合、疏水结合，将(链霉)抗生物素蛋白与微孔板等这样的基板结合，并进一步与经生物素化的蛋白质结合从而固定化的方法。

此外，日本特开平4-236353中还报告了如下技术：首先通过抗生物素蛋白-生物素结合，在结合有生物素的基板上结合抗生物素蛋白蛋白质，然后在此结合经生物素化的期望的蛋白质，其通过与抗生物素蛋白的另外的生物素口袋(biotin pocket)结合，从而得到按照基板-生物素-抗生物素蛋白-生物素-期望的蛋白质这样的顺序进行固定。使用通过这样的方法固定化的板，可以对被检测物质进行检测。