[发明专利]使用多功能生物素类似物的生物分子标记

说明书

本发明涉及生物素类似物，以及使用其标记靶结构和生物分子，例如体内或体外的肽和蛋白的方法。

对细胞信号通路中蛋白表达、定位和/或构象变化的追踪需要创造在体内用对具有荧光基团或其他有用的探针的蛋白进行位点特异性标记的通用工具。传统的化学方法依赖于半胱氨酸或赖氨酸侧链的亲核性，但对于体内应用太过混杂。基因方法，例如与绿色荧光蛋白(GFP)融合，携带了大量负荷(GFP含有238个氨基酸)，并且在变色范围和分光镜读出的性质上很有限。

最近几年，引进了许多用于把小分子探针位点特异性地加到具有特定的肽序列的蛋白上的方法，包括TetraCys/FlAsH体系(B.A.Griffin，S.R.dams，R.Y.Tsien，Science，1998，281，269-272)，HexaHis标记(S.Lata，M.Gavutis，R.Tampe，J.Piehler，JACS，2006，128，2365-2372)，以及polyAsp标签(H.Nonaka，S.Tsukiji，A.Ojida，I.Hamachi，JACS，2007，129，15777-157779)。多种酶介导的标记体系也被报道，包括那些使用分选酶A/SorTag的(M.W.Popp，J.M.Antos，G.M.Grotenbreg，E.Spooner，H.L.Ploegh，Nature Chem.Biol.2007，3，707-708；T.Tanaka，T.Yamamoo，S.Tsukiji，T.Nagmune，CemBioChem，2008，9，802-807)，使用转谷氨酰胺酶/Q-tag的(C.W.Lin，A.Y.Ting，JACS，2006，128，4542-4543)，使用生物素连接酶的(I.Chen，M.Howarth，W.Lin，A.Y.Ting，Nature Methods，2005，2，99-104；M.Howarth，K.Takao，Y.Hyashi，A.Y.Ting，PNAS，2005，102，7583-7588；M.Howarth et al.Nature Methods，2006，3，267-273)以及使用硫辛酸连接酶的(M.Fernandez-Suarez et al.Nature Biotech.2007，25，1483-1487；H.Baruh，S.Puthebveetil，Y.A.Choi，S.Shah，A.Y.Ting，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2008，47，7018-7021)。

许多天然酶演变了底物特异性标记以实现其生物学功能。一个实例是大肠杆菌酶生物素连接酶(BirA)，其参与将来源于重碳酸盐的CO₂转化为有机酸以形成多种细胞代谢物(Chapman-Smith et al.J.Nutr.129：477S-484S，1999)。其在细菌中只有一种天然底物：生物素羧基载体蛋白(BCCP)，其使赖氨酸122生物素化以使其准备被重碳酸盐羧化。Schatz等使用肽筛选确定了能够被识别并且被BirA酶促生物素化的最小的，15个氨基酸的肽序列(Schatz et al.Biotechnology 11：1138-1143，1993；Beckett et al.Protein Sci.8：921-929，1999.)。上述15个氨基酸的序列TTNWVAQAFKMTFDP(SEQ.ID No.19)是最有效的从噬菌体展示文库中发酵生物素连接酶的15个氨基酸受体肽序列(I.Chen，Y.-A.Choi and A.Y.Ting，J.Am.Chem.Soc.2007，129，6619)。将这个被称为″Avi-Tag^TM″的改性序列引入感兴趣的蛋白从而在体外或活菌中进行位点特异性生物素化的纯化的BirA和克隆载体是有售的。(Avidity，Boulder，Colo.USA)是一个源自肺炎克雷伯菌BCCP的72个氨基酸的序列，由Invitrogen以商品名BioEase^TM提供。BioEase^TM表达体系提供了一种表达、纯化以及检测生物素化重组蛋白的方法。BioEase^TM载体包括一个源自肺炎克雷伯菌草酰乙酸脱羧酶的72个氨基酸的序列，其能够在体外指导特定赖氨酸残基的生物素化。载体上制得的蛋白被表达为带有这个序列的融合蛋白。