[发明专利]从hPS细胞来源的定形内胚层诱导获得特定内胚层

说明书

技术领域

本发明涉及控制人多潜能干细胞包括人胚泡来源的干(hBS)细胞分化和获得特定内胚层细胞的方法。

发明背景

前肠衍生器官胰、肺、甲状腺、肝、食道和胃起源于定形内胚层，内胚层为原肠胚形成期间形成的三个胚层之一。特异性转录因子沿着定形内胚层的前部和后部轴(A-P轴)以特定的方式表达，定形内胚层最终形成原始消化道。Forkhead框A1(FOXA1)和FOXA2两者均表达于整个消化道并且因而对于所有胃肠道来源的器官的发育是重要的(Ang等人，1993)。在前肠内胚层的前面部分中，注定变成肺和甲状腺的区域表达NK2同源框1(NKX2.1)，而肝发育自表达造血表达的同源框(HHEX1)的区域。胰和十二指肠起源自表达胰十二指肠同源框(PDX-1)的前肠内胚层的后面部分。消化道内胚层的后面部分发育成为中肠和后肠，中肠和后肠变成小肠和大肠，表达尾型同源框1(CDX1)和CDX2。

成纤维细胞生长因子(FGF)家族控制发育的许多方面，例如细胞迁移、增殖和分化。至少有四种与具有不同亲和力的不同FGF配体结合的不同酪氨酸激酶受体(FGFR1-FGFR4)。此外，FGFR1-FGFR3的选择性剪接产生具有单独表达模式和配体特异性的“IIIb”和“IIIc”同工型。FGF信号转导涉及沿着A-P轴和在胰分化期间消化道的成型(patterning)。

涉及小鼠胚和鸡胚外植体的在先研究已经证实FGF1和FGF2由心脏中胚层分泌并且其可被这些因子的外源性加入代替。在胚胎发生的早期，腹部内胚层与心脏中胚层相邻，而背部内胚层与脊索接触。心脏中胚层对于肝和肺发育是必需的。特别地，FGF2使多能腹部前肠内胚层以浓度依赖性方式成型为肝和肺，而心脏中胚层和FGF的缺失则促进胰形成。尽管FGF2的存在对于腹胰发育不是绝对必需的，但已证实FGF2在背胰形成期间的诱导性作用。背部内胚层最初与分泌激活蛋白βB和FGF2的脊索接触，导致Shh表达的抑制，这对Pdx1表达和背胰发育是必需的。此外，低水平的FGF2诱导培养的小鸡背部内胚层中Pdx1的表达。此外，FGF2还暗示对正在发育的胰中的胰上皮细胞的增殖具有诱导作用并且在成年鼠β细胞中与其它FGF共同表达。

I型糖尿病的普遍性增加以及尸体器官供体胰岛(cadaveric donor islet)的缺乏使得对于开发如下方案引发了极大兴趣：用于指导人胚泡干细胞(hBS细胞)分化成产生胰岛素的β细胞。为更好理解ES细胞向胰内胚层和表达胰岛素的细胞的细胞命运特化的分子机制，需要精细的培养条件。尽管已公布了大量报道体外从hPS细胞获得产生胰岛素的细胞的分化方案，没有一种描述了用于分化过程的单个生长因子的特定作用或讨论了潜在的分子机制。此外，还不清楚这些表达胰岛素的细胞是否代表真正的β细胞。为理解hPS细胞来源的定形内胚层转变成PDX1阳性β祖细胞，我们检验了FGF2的作用。

我们的结果表明在不存在外源性FGF2的情况下，定形内胚层分化成以肝细胞和肠样细胞为特征的前肠和中肠内胚层。重要的是，外源性加入的FGF2以剂量依赖性方式使hPS细胞来源的定形内胚层成型。特别地，在对不同浓度FGF2的应答中，生成肝的、胰的、肠的和前部前肠祖先。此外，生长因子的逐步加入使我们得以进一步剖析调节胰特化的分子程序，显示胰祖先/PDX1表达的诱导依赖于MAPK信号转导途径中FGF2介导的激活。这是首次将FGF2单独与hPS细胞来源的胰内胚层的分化相关联；在此之前，用于获得胰内胚层的方法依赖于在生长因子例如FGF成员与视黄酸酯的组合存在下(参见WO 07/127927)或在这些生长因子与另外的培养基补充物例如B27(WO 09/012428)存在下培养细胞。此处显示的数据因此将有助于开发用于诱导hPS细胞成为前部内胚层和后部内胚层衍生器官肺、食道、胃、肝、胰和肠的新的可重现的方案。

如上所述，当前有关hPS细胞分化成胰的认识主要包括对小鸡、小鼠和有限程度的人细胞的研究。尽管已经报道了hPS细胞分化方案，但还不清楚这些表达胰岛素的细胞是否代表真正的β细胞，这是由于它们的低胰岛素含量和缺乏生理学上葡萄糖介导的胰岛素释放。各种方案在生长因子组成、浓度和加入时间方面存在差异，这一事实表明有必要精确限定在该分化过程中单个生长因子的特定作用和作用模式，以便提供控制细胞分化的方法。

发明描述

本发明涉及将特定浓度的FGF2用作关键因子以控制从hPS细胞来源的定形内胚层细胞分化成特定内胚层细胞。

本发明还提供获得内胚层细胞的方法，所述方法包括FGFR的使用和MAPK信号转导途径的激活。