[发明专利]复杂核酸的扩增

说明书

技术领域

本发明涉及生物学和化学领域，特别涉及分子生物学领域。本发明具体涉及复杂核酸如全基因组、转录物组和亚硫酸氢盐组(bisulfitome)的扩增。

发明背景

复杂模板核酸的扩增在许多分子生物学应用中起着重要的作用。因此对于一些应用而言，需要分别扩增全基因组(全基因组扩增，WGA)、全转录物组(全转录物组扩增，WTA)或全亚硫酸氢盐组(全亚硫酸氢盐组扩增，WBA)。

各种参数对于此类复杂核酸的成功扩增必不可少：

合适的反应条件为必然要求。这包括例如具有适合pH值和适合单价盐和二价盐组成的合适缓冲液。然而，其还包括至少一种合适的聚合酶，并且合适的扩增反应温度是成功扩增的必要因素。

决定性参数为所使用的复杂模板核酸的量。如果复杂模板核酸的量过小，则其将无法满足全基因组的要求。例如，6pg人基因组DNA的量大约相当于单倍体人类基因组。如果用于一个WGA反应的量小于6pg，则在WGA中不能对人类基因组进行完全扩增，因为其不能代表所有的片段。同时，小于100pg的量也可能过小，因为在此量下来自随机效应的特定片段不足或过多。

复杂模板核酸扩增的第三个决定性参数分别为样品或其中包含的复杂模板核酸的质量。术语“质量”可包括不同的方面：

含有复杂模板核酸待扩增样品可具有抑制因子，所述抑制因子以竞争或变构方式抑制所用聚合酶或可破坏聚合酶的活性构象。在下文中，这类物质将被称为反式抑制因子。此类反式抑制因子包括例如重金属离子(例如Ni离子、Fe离子、Mn离子、Zn离子等)、带负电的聚合物(例如肝素、硫酸葡聚糖等)或常常用于核酸制备的蛋白变性物质(例如SDS、酚等)。

然而，样品还可包含与核酸结合从而(例如)通过防止核酸变性或通过防止核酸被聚合酶识别来抑制扩增的物质。在下文中，这类物质将被称为顺式抑制因子。此类顺式抑制因子可为蛋白质(例如组蛋白等)、带正电的物质(例如带正电的聚合物、带正电的氨基酸等)。

核酸可表现出各种缺陷，使得在缺陷位点不再可能通过聚合酶进行延伸反应。这些缺陷位点可为例如单链或双链切口或脱碱基位点存在修饰碱基的位点(例如在DNA中修饰成氧鸟嘌呤或尿嘧啶)。

目前，在复杂模板核酸的扩增反应开始时，仅可在不足的程度上检测这些定量和定性特性。其中存在的待扩增复杂核酸的质量和数量通常并不明确。因此，在存在少量复杂模板核酸的情况下，不能通过OD260测量来进行浓度测量。如果DNA的量足以进行凝胶电泳，则仅可通过凝胶电泳测定DNA损伤。目前尚不能测定其它损伤，诸如脱碱基DNA片段。

例如经由定量PCR对复杂模板核酸的这些定性参数的控制不能令人满意，因为如果模板核酸的平均尺寸＞1kb，则定量PCR仅对部分降解DNA的尺寸差异的检测效果较差。然而，此类尺寸差异对于复杂核酸的扩增而言至关重要。

发明内容

因此，本发明涉及一种对样品中的一种或多种待扩增的复杂模板核酸进行定量和定性分析的方法，其包括以下步骤：

提供反应混合物，其包含

-待扩增的复杂模板核酸；

-指定量的至少一种对照核酸，其中所述对照核酸与模板核酸具有小于50％的序列相同性，并且其中所述对照核酸具有至少一种已知的序列片段；

-用于模板核酸扩增的引物；

-用于对照核酸扩增的引物；

-适于核酸扩增的酶和试剂；

对模板核酸和对照核酸进行共同扩增，其中所述共同扩增等温进行，其中所述共同扩增包括链置换反应，并且其中模板和对照核酸基本上在所述扩增中完全扩增；

完成所述共同扩增后，对扩增的对照核酸进行定量。

因此，在本发明中，将一种或多种外源对照核酸添加到反应混合物中以扩增一种或多种复杂模板核酸。添加适于复杂模板核酸和/或对照核酸扩增的引物和试剂以及酶之后，进行复杂模板和对照核酸的共同扩增。因此，对照核酸与复杂模板核酸平行扩增。对照核酸的扩增程度取决于复杂模板核酸的存在、数量和质量。由于对照核酸和模板核酸竞争扩增反应源(如引物、dNTP、聚合酶)，因此对照为竞争性对照。完成共同扩增后，对扩增的对照核酸进行定量。以此方式测定的数量使得可分别对复杂模板核酸的起始量或质量得出结论。扩增后少量的对照核酸与足够数量和质量的所用复杂模板核酸相关。因此，由较大量的扩增对照核酸可推断所用复杂核酸的数量或质量不足。