[发明专利]用于增加蛋白质产生的芽孢杆菌属菌株

说明书

相关申请的交互参照：

本申请要求2009年6月11日递交的美国临时申请号61/186321的权益，其在此处全文引用作为参考。

本发明提供已经受到基因操作以具有增强的目的蛋白产生能力的宿主细胞。特别地，本发明涉及具有至少一个失活phr和/或rap基因的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞。修饰的芽孢杆菌属宿主细胞的增强的目的蛋白产生在过量表达YmaH的修饰芽孢杆菌属宿主细胞中进一步增加。也提供用于在修饰的宿主细胞中产生目的蛋白的方法。

发明背景

外源多肽的表达和重组产生是一项广泛使用的技术。众所周知细胞可以用编码外源目的多肽的核酸转化用于表达和产生大量想要的多肽。在一些应用中，所述方法用来产生比由起源生物天然产生量要高的多肽。实际上，外源核酸序列的表达以及内源序列的过量表达已经广泛地用于现代生物技术中。

尽管实施了用于增加蛋白酶产量的多种方法，包括筛选超高产菌株、克隆和过量表达蛋白酶、改善补料分批发酵和恒化器发酵和优化发酵技术，但是仍需要用于增强蛋白酶产生的其它手段。

发明概述

本发明提供已经受到基因操作以具有增强的目的蛋白产生能力的宿主细胞。特别地，本发明涉及具有至少一个失活phr和/或rap基因的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞。修饰的芽孢杆菌属宿主细胞的增强的目的蛋白产生在过量表达YmaH的修饰芽孢杆菌属宿主细胞中进一步增加。也提供用于在修饰的宿主细胞中产生目的蛋白的方法。

在一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因和失活rap基因的rap操纵子。优选地，失活的rap基因是rapA基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因和失活rap基因(例如，rapA基因)的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他实施方案中，失活的phr基因是phrE基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他实施方案中，失活的phr基因是phrE基因。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。