[发明专利]岩藻糖基化缺陷型细胞

说明书

技术领域

本发明涉及岩藻糖基化途径中的修饰的哺乳动物酶，其中携带该修饰的哺乳动物酶的细胞显示出降低的使蛋白质岩藻糖基化的能力；还涉及包含遗传修饰的细胞，所述遗传修饰导致降低的使蛋白质岩藻糖基化的能力。本发明包括表达相对于野生型细胞系而言具有减少的岩藻糖基化的蛋白、包括抗体的哺乳动物细胞系(例如CHO系)。本发明还涉及蛋白的岩藻糖基化的条件化控制。

背景技术

不能使蛋白质岩藻糖基化的细胞系是本领域已知的。不能使蛋白质岩藻糖基化的多种功能丧失性突变体是已知的，其中最著名的可能是就针对某些凝集素抗性而选择的某些中国仓鼠卵巢(CHO)细胞突变体。此类细胞系是这样分离的：在存在突变原的情况下，就结合特定凝集素例如兵豆(Lens culinaris)凝集素的无能性而重复进行选择。另外已知报道了其它的不能使蛋白质、例如抗体岩藻糖基化的细胞系，见，例如美国专利号7,425,466和美国专利号7,214,775(α1，6-岩藻糖基转移酶，即FUT8的突变体)。本领域仍然需要具有降低的使蛋白质岩藻糖基化的能力的细胞系，尤其是在不存在敲除的情况下具有降低的岩藻糖基化能力的细胞，以及条件化地岩藻糖基化蛋白质的细胞。

发明内容

在一个方面，提供了分离的经修饰的GDP-4-酮-6-脱氧-甘露糖-3，5-表异构酶-4-还原酶(FX)蛋白，其包含选自下列的修饰：79S，90K，136L，211R，289S及其组合。在一个实施方式中，FX蛋白包含289S修饰。在一个实施方式中，FX蛋白包含289S修饰和选自下列的至少一个修饰：79S，90K，136L，211R及其组合。

在一个方面，提供了编码修饰的FX蛋白序列的核酸。在具体的实施方式中，所述核酸是cDNA。在一个实施方式中，提供了包含所述核酸的表达载体或靶向载体。在一个实施方式中，靶向载体的核酸包含内含子。在一个实施方式中，靶向载体的核酸包含编码修饰的FX蛋白的cDNA。在具体的实施方式中，靶向载体包含使载体靶向人、非人灵长类、仓鼠、小鼠或大鼠基因组中的基因座的靶向序列。

在一个方面，提供了包含编码FX蛋白的核酸的修饰的细胞，或表达具有修饰的FX蛋白的细胞，其中所述细胞不表达或实质上不表达野生型FX蛋白。在具体的实施方式中，所述细胞相对于不含修饰的细胞而言显示出不超过10％、不超过5％、不超过2％或不超过1％的野生型FX蛋白。

在一个实施方式中，包含修饰的FX蛋白或核酸的细胞表达含有Fc的糖蛋白，其中所述细胞相对于不含修饰的细胞而言使不超过90％、不超过95％、不超过96％、不超过97％、不超过98％、或不超过99％的糖蛋白岩藻糖基化。

在一个方面，提供了包含编码FX蛋白的核酸的修饰的细胞，或表达具有修饰的FX蛋白的细胞，其中所述细胞缺乏或实质上缺乏在第一温度使糖蛋白岩藻糖基化的能力，但是不缺乏或实质上不缺乏在第二温度使糖蛋白岩藻糖基化的能力。

在一个实施方式中，第一温度是大约37℃。在一个实施方式中，第二温度是大约34℃。

在一个实施方式中，在第一温度使糖蛋白岩藻糖基化的能力是不含修饰的细胞显示出的使糖蛋白岩藻糖基化的能力的大约1％至大约10％。在一个实施方式中，在第二温度使糖蛋白岩藻糖基化的能力是不含修饰的细胞的使糖蛋白岩藻糖基化的能力的大约70％、80％、90％或更高。

在具体的实施方式中，FX蛋白修饰包含选自下列的氨基酸置换：90K，289S，211R，136L，79S及其组合。在具体的实施方式中，所述置换是289S。

在一个实施方式中，FX蛋白来自非人灵长类[例如，猕猴(Macaca mulatta)]、人、小鼠[例如小家鼠(Mus musculus)]、大鼠[例如褐家鼠(Rattus norvegicus)]或仓鼠[例如中国仓鼠，或中国地鼠(Cricetulus griseus)]。在具体的实施方式中，FX蛋白包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，并且携带如本文描述的一个或多个修饰(例如氨基酸置换)。

在一个实施方式中，编码FX的核酸与SEQ ID NO：1的序列至少90％或至少95％同一，并且在一个或多个如下位置还包含一个或多个如下氨基酸：79S，90K，136L，211R和289S。

在一个实施方式中，编码FX的核酸与SEQ ID NO：2的FX至少95％同一。在具体的实施方式中，FX具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。