[发明专利]用于量化PCR产物的方法、仪器和计算机程序产品

说明书

发明领域

本发明涉及核酸解链曲线分析。更具体地，本发明的实施方案涉及用于在双链核酸的解链曲线图中除去背景信号和提取特定的信号的方法和系统。

解链曲线分析通常与聚合酶链反应(PCR)结合进行，用于分析扩增产物。因此，本发明还涉及用于解链曲线分析以及实时和竞争性PCR技术的仪器和软件。

发明背景

解链曲线分析基于双链核酸(通常为DNA)在溶液中的温度-依赖性解离的测量。双链之间的氢键的解离所需的能量依赖于双链DNA分子的长度和碱基组成，并依赖于相反链的互补性。可使用当与核酸结合时改变其荧光性质的探针，或者当与双链DNA结合时发荧光但是当DNA解离成为单链分子时停止发荧光的荧光染料，来监测链的解离。因此，通过在光学监测荧光的量同时提高样品的温度，可测量存在于样品中的双链DNA的量。

如果样品含有多组具有不同长度或具有不同核苷酸组成的双链DNA分子，测量的结果将包括对于每个分析的DNA分子组具有特异性的温度-依赖性荧光信号的总和。因此，当两种或多种模板PCR扩增之后测量样品中的PCR扩增子时，对于存在于样品中的每个特定的PCR扩增子，可得到特定的温度-依赖性荧光信号。

此外，随着温度升高，荧光信号通常降低，这与双链DNA分子的温度-特异性解离无关地发生。这种荧光信号的降低通常可在整个温度范围观察到，尤其是在其中样品中的DNA分子保持实质上双链的温度下。该背景信号依赖于存在于样品中的双链DNA的量，并且当样品的温度升高时，其以指数方式下降。因此，测量的信号包括由样品中的双链DNA的解离得到的荧光信号的特定降低和温度依赖性的以指数方式下降的背景信号。

实时PCR涉及cDNA或DNA模板的扩增和定量测量扩增的DNA扩增子的量。在该技术中，在PCR扩增的每个循环期间，监测反应中的PCR产物的累积。通过将在样品中的反应产物的累积与在已知的标准物中的反应产物的累积进行比较，可确定存在于样品中的模板DNA的量。此外，基于累积动力学可确定反应效率，但是这种计算的精确度通常被有限的数据点折衷。竞争性PCR提供了一种供选的方法来控制单独的反应管瓶之间的扩增效率的变化。在该技术中，将长度或核苷酸组成与野生型cDNA或DNA模板不同的已知量的参比DNA模板包含在反应中，并且在相同的反应管瓶中与野生型模板共扩增。在扩增之后确定野生型和参比PCR扩增子的相对量。由于，扩增反应效率同等影响野生型和参比模板二者，由野生型和参比PCR扩增子的相对量可确定起初存在于样品中的野生型模板的量。在实时PCR中，在扩增期间进行定量测量，而在竞争性PCR中，通常在完成扩增反应之后进行定量测量。

基于RNA-表达分析的诊断测试面临若干技术挑战。一个具体的挑战为福尔马林-固定、石蜡-包埋的(FFPE)组织样品的分析，其中RNA分子已被降解成为较短的片段。提取和扩增这些短RNA片段是技术上要求高的，并且得到的信号通常低。基因组-受控的RT-PCR已成功地用于该目的(Stenman等人，Clinical Chemistry 52：111988-1996(2006))。该技术基于竞争性PCR并且能扩增和定量测量短cDNA片段，使其适用于分析在FFPE样品中的mRNA表达。在竞争性PCR扩增之后，使用解链曲线分析测量源自野生型cDNA和参比DNA模板的PCR扩增子的相对量。在该技术中，由野生型cDNA和参比DNA模板产生的PCR扩增子的核苷酸组成不同，并且示差检测基于解链温度的轻微差别。该技术存在若干特定的益处。由于在表达的序列和基因组序列之间的分化不依赖于内含子序列，使用基因组-受控的RT-PCR可格外地扩增由实际上任何基因的mRNA产生的短cDNA片段。当分析FFPE样品时，这是必要的。无论存在的野生型cDNA模板的量如何，在每一个反应中参比DNA模板的共扩增提高测定的再现性。通过改变参比模板的量可控制测定的检测限度和不精确性，这对于诊断应用是必要的。另外，来自RNA提取步骤的基因组DNA的遗留不会引起扩增之后的假阳性结果。由于具有接近相等的解链温度的PCR产物的相对水平在跨数个十进制的测量范围内精确地量化，在这种类型的测定中对解链曲线分析的定量性质的要求格外地高。