[发明专利]败血症的质谱诊断

说明书

技术领域

本发明涉及对来自血流感染(败血症)的血液培养物中病原体的质谱鉴定。

背景技术

许多微生物种(以下称为微生物)，特别是细菌和单细胞真菌(如酵母菌或霉菌)还有藻类和原生动物，都可以通过以下方式进行确定性很高的质谱鉴定，即在营养培养基上以通常方式繁殖菌落，然后将少量微生物从所述菌落转移到质谱样品载板上，并用质谱仪直接测量蛋白质谱。质谱图具体地显示了不同可溶性蛋白质的质量和丰度，这些蛋白质以足够高的浓度存在于所述微生物中。通过与质谱库中参考质谱进行相似性分析，所述微生物的这种蛋白质谱可用于来确定其种类。

专门用于此用途的专业质谱仪、相应的评估及相似性分析程序可通过商业渠道获得。现在，该鉴定过程被证明非常成功并迅速被世界各地的微生物实验室所采用。

“鉴定”微生物是指将其按分类学等级分类方案加以分类：域(真核生物和原核生物)、界、门、纲、目、科、属、种，以及亚种。微生物样品的鉴定包括至少确定属，通常是种，如果可能的话还有亚种甚至株，这一点很重要，例如当不同的亚种或株具有不同的病原性时。在更为普遍的意义上，鉴定还可以指表征所述微生物的其他更多个体特性，如微生物对抗生素的抵抗性。

通常含有用于培养菌落的营养培养基作为皮氏培养皿中的琼脂，根据微生物的繁殖力，所述营养培养基使得可在大约六小时到几天内会长出分离的微生物菌落形式的纯菌株。如果菌落互相重叠或大量混合，可采用以普通方法再次进行的二次培养来获得纯菌落。最简单的方法是，将一些微生物从选定菌落以小涂抹棒(swab)转移到质谱仪样品载板上，然后用常规基质物质(通常为α-氰基-4-羟基肉桂酸[HCCA]或2，5-二羟基苯甲酸[DHB])的强酸溶液喷洒，以便借由基质辅助激光解吸(MALDI)进行电离。酸(通常为甲酸或三氟乙酸)可以攻击细胞壁，并且基质溶液的有机溶剂(通常为乙腈)能够渗入微生物的细胞内并使变弱的细胞壁破裂。接下来通过蒸发溶剂干燥样品，这会引起溶解的基质发生结晶。可溶性蛋白和极少量的其他细胞物质会包埋到所述基质晶体中。

然后用质谱仪内紫外线激光的聚焦闪光轰击包埋有分析物分子的所述基质物质晶体，在蒸汽云的高温等离子体内产生分析物分子的离子；然后再根据这些离子的质量将其分离，并在质谱仪内进行测量。为了达到此目的一般会使用专业MALDI飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)。质谱是这些分析物离子的质量值的谱。这些离子绝大部分是蛋白离子，具有最有用信息的离子的质量大约在3,000道尔顿到15,000道尔顿之间。这种方法中的蛋白离子绝大部分仅是单电荷的(电荷数z＝1)，因此允许只提及离子的质量m，而不需总是使用“质荷比”m/z，质荷比在使用其他类型的质谱法时实际是必需的且常规的。

蛋白质的谱恰恰是待研究微生物种的特征，因为每种微生物种均生成其自身的遗传上预先确定的蛋白组，每种蛋白具有其自身的特征性分子量。具有可以用质谱仪检测的较高浓度的蛋白质的丰度也可广泛地采用遗传方法控制，并且仅稍微依赖于营养条件或菌落成熟度。蛋白质谱类似地是不同类型的微生物的特征，如同指纹是每个人的特征一样。如今，公立和私立的研究所以及各大学微生物研究所的许多实验室正在充分扩大可靠的且经验证的充分记录的微生物参考质谱库。这些参考库必须满足严苛的要求才能在医学和法律上得到认可。

本鉴定法已被证明非常成功。其正确鉴定的确定性远高于目前为止所用的微生物鉴定法。对于数百种不同类型的微生物，已有可能证明所述鉴定的确定性超过95％。对于大部分疑案来说(与到目前为止使用的微生物鉴定法的鉴定结果有些偏差)，基因测序已经确认了质谱鉴定的正确性。

如果所述库中没有可用于正在研究的微生物种的参考质谱(这偶尔发生，原因是微生物种达数百万种并且当前谱库的大小有限)，库搜索一般都能够产生有价值的分类将所述微生物分到属或科的较高分类水平，因为相关的微生物经常含有一些相同类型的蛋白质。不过这种情形越来越少见，因为病原微生物现今实际上已全部以参考谱的形式记录在案，因此一般可以精确鉴定到微生物种的水平。

以上简要描述的利用小涂抹棒把一些微生物从菌落转移到质谱仪样品载板的样品点，然后喷洒基质溶液的方法，是最简单且迄今为止最快速的样品制备法。如果培养后可以用肉眼看到菌落，那么即使同时需要分析数百个样品，最多也只需要一到两个小时就可以完成鉴定。带有48、96或384个样品点的质谱仪样品载板均可以从商业渠道获得的；获得这些数量的样品的质谱需要花费半小时到两小时。紧急鉴定时可以在几分钟内鉴定出个体微生物样品(虽然是在培养后，培养总是耗时的)。