[发明专利]生物技术生产软骨素

权利要求书

1.从细菌荚膜多糖前体制备软骨素的方法，其特征是生长和扩增包含至少一份改造拷贝的编码rfaH蛋白或其功能等价片段的序列的细菌。

2.根据权利要求1的方法，其中所述rfaH蛋白编码序列选自：

a.编码细菌中的rfaH蛋白的序列，

b.能够在严紧条件下(例如，包括40至50℃之间的温度，1.2-1.8x HPB)与大肠杆菌rfaH序列杂交的序列。

3.根据权利要求2的方法，其中所述rfaH序列或其功能等价片段包含在具有序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：20的表达盒内。

4.根据权利要求1-3的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)，选自菌株：K5、K4、K30，具有作为多糖前体的K5、K4和K30荚膜多糖，或者所述细菌是多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)。

5.根据权利要求1-4的方法，其中所述生产生物是在位置3的葡糖醛酸残基上具有果糖基化的荚膜多糖软骨素的大肠杆菌菌株EcK4。

6.根据权利要求5的方法，其中所述大肠杆菌K4菌株选自ATCC23502I(美国典型培养物收藏中心——USA)、菌株Bi 8337/41(国际埃希氏菌中心——丹麦)、菌株NCTC 9005(英国国立典型培养物收藏中心——UK)、菌株U1-41 2616(Freiburg收藏中心)。

7.根据权利要求1-6的方法，其中所述rfaH蛋白编码序列是通过插入多个基因拷贝而改造的。

8.根据权利要求7的方法，其中所述多基因拷贝包括在染色体DNA、质粒元件或可转座元件中。

9.根据权利要求8的方法，其中所述质粒元件是K4中的内源性质粒，优选的特征是至少包括序列ID NO：1和ID NO：6。

10.根据权利要求1-9的方法，其中所述rfaH蛋白编码序列是通过插入组成型启动子而改造的。

11.根据权利要求10的方法，其中所述组成型启动子选自甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因的多重启动子和其他大肠杆菌蛋白质的组成型启动子，及其功能性等价片段。

12.根据权利要求1-11的方法，其中细菌的生长和扩增是通过在含有至少一种有机氮源、一种碳源和矿物盐的复杂培养基中培养而进行的。

13.根据权利要求12的方法，其中所述有机氮源选自一种或多种下列化合物：酵母提取物、bacto casitone、胰蛋白胨、豆粉、棉花粉、豌豆粉；碳源选自一种或多种下列化合物：葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、玉米浆、甘油；矿物盐选自一种或多种下列的盐：磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、盐酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐、锰盐、铁盐、铜盐。

14.根据权利要求12-13的方法，其中在培养基中，有机氮源的比例范围从0.1至10％，优选从0.1至3％，碳源的比例范围从0.1至20％，优选从0.5至5％，矿物盐的比例范围从1至5％，优选从1.5至2.5％。

15.根据权利要求1-14的方法，其中细菌的生长和扩增是在分批发酵的条件下进行的。

16.根据权利要求15的方法，其中，在分批阶段末期，随着营养物减少，通过添加浓缩的营养物溶液按补料-分批分案进行发酵。

17.根据权利要求16的方法，其中浓缩的营养物溶液包括碳源，例如甘油、葡萄糖、糊精、淀粉、玉米浆或其组合；和氮源，例如酵母提取物、大豆蛋白胨、植物蛋白水解物或其组合。

18.根据权利要求12-17的方法，其中碳源和氮源的重量比范围从1至20，优选从5至10。

19.根据权利要求16-18的方法，其中浓缩营养物溶液的添加是在检测了发酵材料的pO₂后进行的，且其中所述pO₂维持在10-50％，优选25-35％的空气饱和范围内。