[发明专利]CARBA-NAD的酶促合成

说明书

技术领域

本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD/NADH和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP/NADPH的稳定类似物、即所谓“carba-NAD”，如分别包含代替核糖的碳环糖的NAD/NADH或NADP/NADPH的类似物的酶促合成。

背景技术

用于生化分析的测量系统是临床相关分析方法的重要组成部分。其首先涉及分析物、例如借助酶而直接或间接地测定的代谢物或底物的测量。目标分析物常常借助酶-辅酶复合物进行转化，随后经由该酶促反应来定量。在该过程中，在合适反应条件下待测定的分析物与适合的酶以及辅酶接触，由此辅酶发生改变，例如通过酶促反应而被氧化或被还原。该过程可直接地或借助中介物而以电化学法或光度法来测定。通常，标准曲线提供测量值与目标分析物浓度之间的直接相关，由此可测定分析物浓度。

辅酶是共价或非共价地与酶结合的有机分子，并且通过分析物的转化而发生变化。辅酶的突出实例是可通过还原分别形成NADH和NADPH的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。

如US 2008/0213809中所描述，常规测量系统的缺陷，如有限的贮藏期限，对贮藏条件如冷却或干燥贮存的特殊要求以实现改良的贮藏寿命，可以通过本文公开的稳定的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)衍生物而在至少很大程度上克服。这些稳定的NAD(P)H类似物适于消除由于不恰当、疏忽、不良的贮藏所引起的错误结果，所述储藏在例如由最终用户自己进行的测试如葡萄糖自我监测中是特别重要的。

如US 2008/0213809中所描述，carba-NAD的化学合成极其有挑战性，需要至少8个合成步骤，具有相当低的产率，因此相当昂贵。附图1描述了合成carba-NAD的化学路线。急需可替代的合成路线。

因此，本发明的目的在于以较少繁琐的方式，以高产率和有吸引力的低成本提供carba-NAD。

目前意外地发现，可以利用酶替代传统化学方式而以节省成本和便利的方式来提供carba-NAD。

发明内容

本发明涉及酶促合成carba-NAD或其类似物的方法，该方法包括以下步骤：a)借助NRK酶将3-氨基甲酰基-1-(2，3-二羟基-4-羟甲基-环戊基)-吡啶鎓-甲磺酸盐或其类似物磷酸化，b)借助NMN-AT酶，用腺苷或结构相关的化合物将步骤(a)的磷酸化产物腺苷酸化，由此获得carba-NAD或其类似物。

具体实施方式

优选实施方式中，本发明涉及合成carba-NAD或其类似物的方法，该方法包括以下步骤：

a)借助烟酰胺核糖激酶(NRK)酶，将式I的化合物磷酸化，

其中R1为OH、NH₂、O-甲基或N-二甲基、甲基，Y-为反离子，X为O或S，

b)借助NMN-AT酶，用式II的化合物将步骤(a)的磷酸化产物腺苷酸化，

其中R2为NH₂、OH或NH烷基，

其中R3为H、OH或NH₂，

由此获得式III的carba-NAD或其类似物，

式III

其中，R1、R2、R3、Y-和X如上文所定义。

上述方法还通过图2所示反应流程进行例示。

术语“carba-”用来表示代替核糖基糖残基而存在2，3-二羟基环戊烷。换言之，氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD’)的carba-类似物，例如，除了2，3-二羟基环戊烷环置换烟酰胺核苷部分的D-核糖核苷酸环之外，是与(NAD’)相同的化合物(Slama，J.T. and Simmons，A.M.，Biochemistry 27(1988)1831)。

酶已知是高度特异性的催化剂，其允许在差不多的生理条件下发生反应，当酶不在时则需要苛刻条件或者有时甚至几乎无法完成反应。为了能够进行这样的特异性反应，作为在选择压力下经由一代代进化的结果，酶在底物专一性以及催化的反应方面都趋向于具有非常的特异性。目前意外地发现烟酰胺核糖激酶接受含有2，3-二羟基环戊烷环来代替核糖残基的式I的吡啶鎓化合物来作为底物，并且可以将这些化合物磷酸化。