[发明专利]去除逆转录和扩增反应中的核酸污染的方法

说明书

发明领域

本发明涉及通过使用DNase从逆转录反应混合物、热启动DNA聚合酶制剂和热启动PCR反应混合物中去除污染DNA。本发明还涉及通过使用DNase来防止核酸扩增反应，尤其是涉及靶序列的逆转录、热启动DNA聚合酶和/或隔离热启动PCR装置的扩增反应中的假阳性结果。本发明还涉及适用于这些方法的极不耐热的DNase。

发明背景

核酸扩增技术如聚合酶链式反应(PCR)是可用于生物技术领域中的最有力的工具之一，其允许由仅含有少量核酸的样品制备出大量拷贝的靶序列。就PCR而言，将与双链靶序列的各链互补的寡核苷酸引物添加到含有靶序列和游离核苷酸的反应混合物中。在DNA聚合酶存在下的热循环导致引物间序列的扩增。由PCR过程所产生的扩增片段能用作随后PCR循环的模板的能力导致快速产生大量的靶序列。即使一个拷贝的靶序列也能够产生足以允许通过例如与标记探针杂交或将³²P标记的脱氧核苷三磷酸掺入扩增节段检测的核酸

连接酶扩增反应(LAR)也称为连接酶链式反应(LCR)，与PCR类似，其利用重复循环和交替温度来实现靶序列拷贝数的指数增加。在这种方法中，DNA连接酶催化与靶DNA链中的一条的邻近区互补的两段寡核苷酸的连接。与另一条链互补的另两段寡核苷酸也可以被连接。变性之后，最初的模板链和两段连接对可以用作下一轮杂交和连接的模板。

链置换扩增(SDA)利用参与DNA切除DNA修复的酶的特性来用新合成的链替换DNA双螺旋中的一条带缺口的DNA链。为了重复产生带缺口的单链，使用诸如HindI或BsoBI的限制性内切核酸酶，当DNA的互补链被半硫代磷酸化时，这些限制性内切核酸酶仅在其识别位点的一条链上使DNA产生缺口。本方法中所用的引物含有合适的识别位点，并且在聚合反应中使用dATPαS。

基于核酸序列的扩增(NASBA)也称为3SR(自主序列复制)，本质上是天然逆转录病毒转录的体外形式。3SR涉及由RNA模板重复逆转录以形成cDNA模板。RNA聚合酶从cDNA模板产生相应的RNA。

环介导的等温扩增(LAMP；Notomi，T.等，Nuc.Acid Res.2000 VoI 28(12)e63)是基于自动循环的链置换DNA合成的原则。具有高的链置换活性的DNA聚合酶(例如，Bst DNA聚合酶大片段)与特异设计的引物一起使用。该过程在不需要解链的情况下通过链分离来展现新的靶序列(因而该过程是等温的)。

逆转录是这样的过程，在该过程中，单链RNA(ssRNA)模板被转录成互补的单链DNA，然后，单链DNA可用来形成双链DNA(dsDNA)。一些酶能够产生第一DNA链且能够合成第二链以形成dsDNA，而其它酶仅对两个步骤中的一个是特异的。然后，ssDNA和dsDNA可用于多种分子生物学应用中。例如，它们能直接用于基于探针的检测测定(例如Southern印迹)、测序实验或克隆方案中。通常，cDNA在诸如PCR、LCR、SDA、LAMP或3SR的扩增反应中可被进一步扩增，从而例如为上述实验提供更多的物质或者能够定量初始样品中所存在的RNA模板的量。

逆转录连接的扩增反应可以是“一步”法或“两步”法。在一步法中，逆转录反应和核酸扩增反应中的组分存在于一个反应容器中，并且通常选择早期反应条件以允许进行逆转录反应至完成，然后将反应条件转换成适于允许进行核酸扩增反应的条件。

在两步法中，首先将逆转录反应的组分混合，并进行逆转录反应。然后将逆转录产物与扩增反应的组分混合，并进行扩增反应。在“一管”两步方案中，将扩增反应组分添加至进行逆转录反应的同一反应容器中。在“两管”两步方案中，在新的反应容器中进行扩增反应。

在一步法或两步法中，逆转录可以与PCA、LAMP、LCR、SDA或BSR中的任一种联合。就SDA而言，应选择热稳定的链置换酶和热稳定的限制性酶(例如BsoB1)。