[发明专利]用于定量生物样品中DNA的改良方法

说明书

背景

本发明涉及定量生物样品中对命名为Bt11的转基因玉米事件为独特的核酸的改良方法并且涉及在开展所述方法中有用的组合物。

随着实施关于转基因作物植物的规定，例如欧盟委员会(EC)第1139/98号规定、EC第49/2000号规定和EC第50/2000号规定，需要精确测量来自转基因物种中的DNA的水平，其中所述的DNA可能存在于例如用于食物的谷类中。因为欧盟委员会常务委员会在1999年制定的用于标记的阈值是1％，故检测并定量来自这些转基因植物的DNA的分析方法已经特别受到众多关注。

可以通过任何熟知的核酸检测方法，包括但不限于使用多核苷酸引物的热扩增法(聚合酶链反应(PCR))或使用核酸探针的DNA杂交法，检测转基因的存在。一般而言，为简化和统一在检测已用于转化多个植物品种的特定DNA构建体中使用的试剂和方法学，这些检测方法通常侧重于频繁所用的遗传元件，例如，启动子、终止子和标记基因，因为对于许多DNA构建体而言编码序列区是可互换的。因此，此类方法可能无法用于区分仅就编码序列而言不同的构建体。此外，此类方法可能无法用于区分不同的转基因事件，尤其使用相同DNA构建体所产生的那些转基因事件。

为区别转基因事件，已经开发了事件特异性PCR方法。异源DNA构建体插入植物的基因组中产生在整合的DNA序列与植物基因组序列之间的单一事件特异性接点。已经开发用于转基因事件的事件特异性定量PCR(qPCR)方法，包括用于Bt11的一种事件特异性定量PCR方法。可能限制此类方法应用的因素可以包括，例如，初始DNA浓度的影响、管理机构制定的标准、引物和PCR方案的选择、样品与样品的重复性、不同实验室之间的重现性和低水平检测与高灵敏度的阈值。

出于前述原因，对于改善定量检测生物样品中来自Bt11转基因玉米事件的核酸存在需求。

发明简述

本发明涉及命名为Bt11的转化玉米(玉蜀黍(Zea mays))事件，其包含两个异源表达盒，一个异源表达盒包含cry1Ab编码序列，所述的cry1Ab编码序列编码对Bt11玉米植物赋予抗虫性的Cry1Ab杀虫蛋白，并且另一个异源表达盒包含pat编码序列，所述的pat编码序列编码对Bt11玉米植物赋予草铵膦除草剂抗性的PAT蛋白。Bt11事件的产生在其内容因而通过引用方式并入的美国专利号6,114,608中描述。这两个表达盒插在第8号染色体长臂上的15cM区域内，接近第117位置并且处于侧翼分布有两个公用标记ZIB3和UMC150a的间隔内。

本发明提供用于生物样品中相对于内源性玉米(Zea mays)adh1基因定量检测Bt11-特异性DNA的组合物和改良方法。这种对Bt11DNA在例如包含Bt11谷粒和非Bt11谷粒的玉米粒混合物中的定量基于设计旨在检测Bt11中5′连接序列的引物对和探针。

在本发明的一个方面，提供一种定量包含玉米核酸的生物样品中事件Bt11DNA的方法，其中该方法包括(a)使所述生物样品与包含由SEQ ID NO：1组成的第一引物和由SEQ ID NO：2组成的第二引物的第一对引物和包含SEQ ID NO：3的荧光染料标记探针接触，其中在具有来自事件Bt11玉米的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，所述第一对引物产生包含SEQ ID NO：4的第一扩增子并且其中所述第一扩增子用于确定事件Bt11；(b)使所述生物样品与包含由SEQ ID NO：5组成的第一引物和由SEQ ID NO：6组成的第二引物的第二对引物和包含SEQ ID NO：7的第二荧光染料标记探针接触，其中在具有玉米基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，所述第二对引物产生包含SEQ ID NO：8的第二扩增子，并且其中所述第二扩增子指示玉米adh1基因的存在；(c)提供能够进行定量实时PCR的核酸扩增反应条件和PCR仪；(d)使用(a)和(b)的引物和探针进行定量实时PCR，因而产生所述的第一扩增子和所述的第二扩增子；(e)当第一扩增子和第二扩增子由所述PCR仪产生时，同时检测它们；并且(f)与所述第二扩增子比较计算所述第一扩增子的相对量，因而第一扩增子的量指示Bt11DNA在生物样品中的量。

在另一个方面中，本发明提供了包含由SEQ ID NO：1组成的第一引物和由SEQ ID NO：2组成的第二引物的一对引物，其中在具有来自事件Bt11玉米的基因组DNA的PCR中使用时，该对引物产生包含用于确定玉米事件Bt11的SEQ ID NO：4的扩增子。