[发明专利]新的肽酶底物

说明书

技术领域

本发明涉及新的化合物，其可用作pH指示剂和/或用作检测肽酶活性的酶底物。这些底物可用于包括产生物理化学信号的酶促水解步骤的应用中，特别用于微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中。本发明还涉及包含所述底物的反应培养基、所述底物或者所述培养基用于检测肽酶活性和/或区分革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌的用途，还涉及使用方法。

背景技术

目前已有大量用于检测微生物的培养基。这种检测具体地可基于使用对期望检测的微生物的酶具有特异性的特定底物。一般而言，制备酶的合成底物以使该底物与其靶酶代谢的产物具有不同的物理化学性质，从而可区分它们，并且评价是否全部或者部分的底物已被酶转化成产物。水解酶底物通常由对要显示的酶活性特异性的第一部分以及用作标记物的第二部分(通常是发色或者发荧光的)组成。因此，在细菌的情况中，通过选择底物，根据是否存在反应，可表征微生物的性质。肽酶活性可具体用来显示细菌的群、属或者种。因此，例如，丙氨酸-氨肽酶活性使得可以区分革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌。

用于检测肽酶活性的酶发色底物是本领域已知的。可具体提及的是Manafi的文章(Manafi等人，Microbiol Rev 55(3)：335-348，1991)，这是关于用于微生物学的酶底物的综述。但是，所述的氨肽酶底物通过水解释放扩散于培养基中的化合物(β-萘基胺，7-氨基-4-甲基香豆素)。因此，在非均相反应培养基(培养皿上的菌落、组织切片等)中，不可能准确定位水解的位置。还可提及由本申请人提交的专利申请WO 98/04735和WO 99/38995中所述的底物。但是，虽然这些底物少量扩散于培养基中，但是它们具有某些缺点：它们难以合成，纯度低，收率低，并且它们对某些微生物具有毒性。

发明内容

因此，本发明提出新的化合物的用途，其用作pH指示剂，或者用作肽酶底物，能够用来检测微生物。较之现有的底物，这些新的化合物易于合成，并且可具体地用于凝胶化的培养基中来检测微生物，因为它们产生的显色在反应培养基中少量或者根本不扩散。在用作酶底物的情况中，这使得能够在不表达肽酶活性的其他菌落或细胞器中准确地定位表达肽酶活性的菌落或者细胞器。

在进一步描述本发明之前，为了便于公开本发明而作出以下定义。

术语“酶底物”是指这样底物，其可被酶水解成允许直接或间接地检测微生物、细胞或细胞器的产物。所述底物具体地包含对要显示的酶活性特异性的第一部分以及用作标记物的第二部分。

本发明的用作底物的化合物适合用于流式细胞术，由于水解的产物主要保持位于表达酶活性的细胞中，因此可特异性地对表达此活性的细胞进行计数，乃至将它们从样品的其余部分分离。

本发明的用作底物的化合物还非常适合用于组织酶学，由于水解的产物主要保持在水解的位置处，因此可特异性地鉴定在组织内表达此活性的细胞或者细胞器。

本发明的化合物由于它们的低毒性而非常适合分别用作pH指示剂，或者监测细胞培养物中的肽酶活性。

本发明的化合物特别适合用于检测和/或鉴定培养基，因为它们产生不扩散于反应培养基中的显色或者荧光。

在本发明中，术语“显色”涵盖染色、吸收可见光谱的光或者荧光，以及在一种波长吸收(λ_ex)并在更高的波长发射(λ_em，λ_em＞λ_ex)。

本发明的化合物可成盐，即为盐的形式，例如，氯化物、溴化物、碘化物或者三氟乙酸盐。

术语“pH指示剂”是指颜色和/或荧光随着培养基的pH改变而改变的化学物质，其中所述pH改变任选地与在所述培养基上生长的微生物的代谢相关。

术语“肽酶”是指能够通过水解切割肽的酰基残基与伯胺之间形成的酰胺基团的酶。术语“氨肽酶”是指能够通过水解切割氨基酸的酰基与伯胺之间形成的酰胺基团的酶。在本申请中，术语“肽酶”可适当地表示以上定义的肽酶和氨肽酶。

术语“肽”是指包含1-10个氨基酸，优选1-4个氨基酸的肽链。优选地，所述肽是二丙氨酸或者三丙氨酸。术语“氨基酸”是指本领域技术人员已知的任何天然的或者非天然的氨基酸。根据本发明的一具体实施方案，所述氨基酸是β-丙氨酸或L-丙氨酸或D-丙氨酸，或者甘氨酸、焦谷氨酰基等。