[发明专利]核酸递送组合物及其使用方法

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求于2009年6月1日提交的美国临时申请号61/182,832的优先权，该申请的公开内容通过引用合并入本文。

技术领域

本公开书涉及用于转导细胞的组合物和方法。

背景技术

已经使用各种各样的重组病毒载体、脂质递送系统和电穿孔在体外和体内进行核酸至细胞的递送。这些技术通过敲除基因表达或提供用于基因治疗的遗传构建物设法治疗各种疾病和病症或研究不同的生物系统。

聚阴离子寡聚物诸如寡核苷酸不容易跨细胞膜扩散。为了克服培养细胞的这个问题，阳离子脂质与阴离子寡核苷酸结合以帮助摄取。不幸的是，该复合物对细胞通常是有毒的，这意味着必须小心地控制阳离子脂的暴露时间和浓度，以保证活细胞的转染。

作为选择性降解mRNA的细胞机理的RNA干扰的发现使得可以靶向操作细胞培养物的表型和发展定向治疗技术(Behlke，Mol.Ther.13，644-670，2006；Xie等人，Drug Discov.Today 11，67-73，2006)。然而，由于它们的大小和负(阴离子)电荷的性质，siRNA是不能进入细胞的大分子。实际上，siRNA超过了Lipinski的用于细胞递送膜可扩散分子的“5s规则”(Rule of 5s)的25倍，在该规则中，通常膜可扩散分子限制为小于500Da的尺寸。因此，在不存在递送载体或转染剂时，裸露的siRNA不进入细胞，即使在毫摩尔的浓度下也不能(Barquinero等人，Gene Ther.11 Suppl 1，S3-9，2004)。重要的关注集中在使用阳离子脂质上，其凝聚siRNA并在细胞膜上打孔来解决siRNA的递送问题。尽管已经广泛使用，但转染剂不能实现有效地递送到许多细胞类型，尤其是原代细胞和造血细胞系中(T细胞和B细胞，巨噬细胞)。而且脂质转染试剂经常导致不同程度的细胞毒性，从肿瘤细胞中的轻度到原代细胞中的高度的细胞毒性。

发明内容

本公开书提供了用于将掩蔽的寡核苷酸或多核苷酸递送到活细胞中的方法和组合物。本发明提供了短暂保护的寡核苷酸或多核苷酸，其包含阴离子电荷中和部分/基团。在一个实施方案中，所述电荷中和部分包含碱性/阳离子电荷。在另一个实施方案中，所述部分包括沿本发明的三酯保护基团的伯胺、仲胺或叔胺。这些化合物可以通过胞吞或大型胞饮机制进入活细胞的细胞胞质。在一个实施方案中，所述磷酸三酯保护/中和基团当暴露于细胞内环境时，被设计成通过酶活性或通过被动的细胞内方法(例如，pH改变)除去，以提供能够诱发RNAi应答的寡核苷酸或多核苷酸。因此，本发明提供了可用作治疗剂、诊断剂和作为研究工具的寡核苷酸前药。

本公开书提供了RNAi诱导的单个可溶性核糖核酸碱(siRNB)分子。在一些实施方案中，siRNB分子与肽转导结构域(PTD)细胞递送肽(PTD-siRNB)缀合，所述肽转导结构域(PTD)细胞递送肽(PTD-siRNB)＜2x10⁴Da。RNB亚磷酰胺结构单元被改造从而包含生物学可逆的氨基异丁基S-酰基硫代乙基碱性磷酸三酯，其被细胞质硫酯酶特异性地去除，导致反转为野生型磷酸二酯。自递送的PTD-siRNB在培养的原代和转化细胞的全部群体中诱导快速的RNAi应答，并且在小鼠模型的鼻和上呼吸道中体内诱导RNAi应答。PTD-siRNB代表一种新型的诱导RNAi应答的单个可溶性分子方式。

本公开书提供了伯胺基团形式(pKa＞9.0)的碱性(正)电荷，其使RNB可溶于水中，并且不会被PTD递送肽从溶液中驱除。

本公开书提供了在电荷中和的寡核苷酸中使用的修饰核苷酸。核苷酸包含与核苷酸的磷酸基团缀合的氨基烷基S-酰基硫代烷基(“电荷中和部分”或“N-SATE”)。中和基团协助包含所述修饰的核苷酸的寡核苷酸跨细胞膜运输。一旦被细胞摄取，所述中和基团被例如内源性或外源性硫酯酶去除。

在一个实施方案中，用于将N-SATE添加至寡核苷酸(例如，和RNA寡核苷酸)的结构单元包含电荷中和部分，所述电荷中和部分具有下列通式结构：

其中R是氨基或末端为氨基的1-7个原子的烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂环或取代的杂环。前述结构可以在生成siRNB分子的RNA合成反应期间加入。

在一个实施方案中，所述电荷中和部分包含具有下列通式结构的N-SATE：