[发明专利]用于产生甜蛋白的方法

说明书

涉及序列表

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技术领域

本发明涉及在丝状真菌中产生重组甜蛋白的方法。本发明还涉及编码所述甜蛋白的分离的多核苷酸，并涉及包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用通过本发明方法产生的甜蛋白的方法。

背景技术

由于肥胖对健康的负面作用受到日益关注，对具有包括例如减少的热量等不同营养特征的食物和饮料产品的市场需求随之增加。有用无营养性增甜剂(non-nutritional sweetener)替代通常用于食物和饮料产品的高热量增甜剂如蔗糖和高果糖玉米糖浆(high fructose corn syrup，HFCS)的市场需求。已鉴定了许多此类无营养性增甜剂。其中一些为天然地见于植物的小蛋白(small protein)。此类蛋白通常称作甜蛋白。

Brazzein是一种可从西非攀缘植物Pentadiplandra brazzeana(Baillon)(WO9531547)提取的甜蛋白。其表征为单体蛋白，其三维结构具有四个均匀分布的二硫键。在自然界该蛋白似存在三种形式，其区别仅在于N端氨基酸残基。一种对应于预测的54-氨基酸的翻译产物，在其N末端含有谷氨酰胺。已显示该形式是短命的，因为该N端谷氨酰胺发生天然转变称为焦谷氨酸(pyroglutamate)，得到第二种形式。N端谷氨酰胺或焦谷氨酸的丧失得到53-氨基酸的形式，据报道，其甜度为具有N端焦谷氨酸的形式的两倍(Lamphear，Barry J.等(2005)Plant Biotechnology Journal 3(1)：103-114)。

按重量计，Brazzein的甜度是蔗糖的500至2000倍。其甜味感觉(sweet perception)非常类似于蔗糖，具有清楚的甜味并具有萦绕的余味(aftertaste)。此外，已显示其在较宽的pH范围(2.5至8)内是稳定的，且可耐热，这使其适于许多工业上的食物制造工艺。作为蛋白，其对于糖尿病患者是安全的，且其非常易溶于水(＞50mg/ml)。因此，Brazzein代表了其他可获得的低热量增甜剂的非常良好的替代品。

然而，从P.brazzeana天然获得是困难而昂贵的，因此正在搜索获得该蛋白的替代方案。Brazzein可化学合成，其可用于小规模产生例如变体，但不适于大规模生产。已描述了在大肠杆菌中异源产生Brazzein或Brazzein变体(参见，例如Assadi-Porter，F.M.等(2000)Arch.Biochem.Biophys.376(2)：252-258；WO2008112475)。细菌系统对于结构研究是理想的，因为其易于遗传操纵，并非常适于同位素标记。从大肠杆菌进行植物蛋白的表达可利用在细胞内形成包涵体的优点来进行，所述包涵体可非常容易地与宿主蛋白分离。然而，蛋白在包涵体中解折叠并沉淀，而在重新溶解和重新折叠之后控制正确的S-S键形成并不总是容易的(参见，例如Tamás和Shewry(2006)Journal of Cereal Science 43：259-274)。而且，使用包涵体的异源蛋白表达通常需要多个纯化步骤，这使得此类系统较不适于工业规模的生产。

亦已描述了针对植物如玉米或小麦的遗传工程改造。已证明来自玉米的含有Brazzein的胚粉(germ flour)作为提供针对蔗糖的低热量替代品的低强度增甜剂是有用的，其还提供了固有的填充性能(bulking property)，这对于替代糖去除所致的体积丧失是必需的。而且，基于玉米表达的Brazzein的高强度增甜剂可潜在地藉由此种材料的富集而提供，其可拓展产品应用的范围(Lamphear，Barry J.等(2005)Plant Biotechnology Journal 3(1)：103-114)。