[发明专利]作为氧化应激标志物的GP91PHOX的体外检测法

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测生物液体中的gp91^phox蛋白的非酶促的体外方法，所述gp91^phox蛋白作为NADPH氧化酶激活以及氧化应激的标志物。

背景技术

活性氧(ROS)是小的高度反应性的分子，其存在于人类和动物体内并源于氧。ROS能够通过与DNA、蛋白质和脂质分子反应而改变细胞的功能，其通常作为不同代谢途径的副产物存在于生物系统中。它们还在细胞信号转导和免疫系统细胞活性的调节中具有关键作用。

氧化应激(oxidative stress)定义为：就可用的细胞抗氧化电位而言，ROS的生产与存在之间的严重失衡。其能够导致一系列生理破坏并由此能够造成病症的发作。潜在地，氧化应激可以牵涉并破坏任何细胞成分，例如DNA、碳水化合物和蛋白质。有多种代谢疾病的特征都在于存在明显的氧化应激，其中有：糖尿病、高胆固醇血症、高脂血症和心血管疾病、例如高血压、动脉粥样硬化、心脏肥大和心肌梗塞。在败血病和具有强炎性成分的疾病例如类风湿性关节炎中也检测到了高水平的氧化应激(Cave A.C.et al.，Antiox.Redox Signal.(2006)8：691-728；Valko M.et al.，Int.J.Biochem.Cell.Biol.(2007)39：44-84)。

氧化应激本身是难以被抓住并在体内进行测定的现象。这是因为ROS的寿命非常短，并且不能在血液或组织中被检测。因此，只能通过间接方法来测定它们的水平，例如在细胞DNA或在氨基酸中检测它们的衍生物，但是细胞的ROS生产的这些副产物与实际的氧化应激之间的精确关联尚未被证明(Halliwell B.and Whiteman M.，Br.J.Pharmacol.(2004)142：231-255)。通常使用的体外方法是通过使用荧光探针例如二氯荧光素二酯(DCFH)、双氢罗丹明(DHR)、鲁米诺和光泽精来检测ROS，但是其不能被转化为体内检测方法。

脂质过氧化是相当复杂的过程，其产生数量差异巨大的多种不同的化合物。虽然如此，检测所产生的此类化合物仍然被认为是氧化应激的有用的指标。

体内的氧化应激水平目前是通过EIA或ELISA法检测尿中的异前列烷来测定的(Wang Z.et al.，Pharmacol.Exp.Ther.(1995)275：94-100；US 6,620,800；US 5,700,654，US 5,891,622)或通过质谱法测定的(M.S.Lawson et al.，J.Biol.Chem.(1999)274：2441-2444)。在我们的体内，异前列烷是通过花生四烯酸(AA)的直接过氧化而产生的，无任何酶促过程的干预，因此被认为是体内过氧化的直接度量。

在细胞生产ROS时，NADPH氧化酶发挥着关键作用，该酶是最初发现于吞噬细胞中的多亚基蛋白。NADPH氧化酶包含5个亚基，其中的催化亚基是被称作Nox的膜蛋白(已知其有5种不同亚型)。在免疫吞噬性细胞、例如嗜中性粒细胞和巨噬细胞中存在的Nox亚型是Nox2，其也被称作gp91^phox，在这些细胞中，其负责超氧阴离子的产生，继而产生氧过氧化物(oxygen peroxide)，这会允许这些细胞在感染过程中杀死细菌细胞。当gp91^phox主要与该酶的第二个膜亚基即p22^phox相互作用时，吞噬性NADPH氧化酶被激活，随后，通常存在于细胞质中的其余亚基p47^phox、p67^phox和Rac1-2被募集于质膜上以重构工作酶(Sheppard FR et al.，J Leukoc Biol(2005)78：1025-1042)。