[发明专利]包含甘露糖启动子的载体和甘露糖启动子

说明书

本发明涉及在原核宿主细胞中可表达的载体，其包含甘露糖可诱导的启动子，该启动子用于，编码例如多肽、例如重组蛋白的核酸的异源表达。

具体地，本发明涉及用于在宿主中异源表达的新的载体，其包含可操作地连接于转录单元的甘露糖操纵子的启动子区，所述转录单元包含对于所述宿主而言为异源的核酸序列，而所述核酸序列的表达受到所述甘露糖操纵子的启动子区的控制。此外，本发明涉及这些载体用于异源表达编码例如多肽、例如重组蛋白的核酸的用途。

已经描述了很多用于在原核系统中异源表达编码例如多肽的核酸(结构基因)的系统。为此，以包含可操作地连接于启动子的目标结构基因的核酸序列的载体转化宿主，所述启动子是能够使结构基因被转录的核酸序列。通过适当的诱导，启动子被激活并允许结构基因的转录。诱导可以在阴性或阳性控制下。

在阴性控制诱导中，阻抑子与启动子结合并阻止结构基因的转录。如果存在合适的诱导子，则阻抑子被失活而转录被允许。

在阳性控制诱导中，当与激活子结合之后，启动子被激活，其中激活子与启动子的结合由合适的诱导子介导。

典型的诱导子可以是：原核宿主代谢所需的底物，例如，不同种类的糖。

本发明涉及阳性可诱导系统，其中，在存在适当的底物即诱导子时，激活子与启动子结合，这会启动可操作地连接于所述启动子的基因的转录。

到目前为止，原核宿主系统中的多数异源基因表达系统都专有性地依赖于细菌启动子的有限的集合。所以，可以用作诱导子的底物的数目也是有限的。

此外，异源表达系统的产率依赖于可利用的经转化的原核宿主的数目。因此，需要能够生长至高细胞密度的原核宿主系统，即，允许快速增殖而不在细胞分裂时丧失载体。

发明内容

根据本发明，通过提供下列新的载体而实现了这些和其它目标，其将通过以下说明书而变得明显，所述新的载体包含可操作地连接于转录单元的甘露糖操纵子的启动子区，所述转录单元包含对于所述宿主而言为异源的核酸序列，而所述核酸序列的表达受到所述甘露糖操纵子的启动子区的控制。

还提供了所述新的载体用于核酸序列在原核宿主中的受控的异源表达的用途；在宿主中可表达的分离且纯化的核酸序列，其包含甘露糖操纵子的启动子区；以所述载体或所述分离且纯化的核酸序列转化的原核宿主；使用所述载体或所述分离且纯化的核酸序列在宿主中生产多肽的方法；以及以所述载体或所述分离且纯化的核酸序列转化的原核宿主在发酵、特别是高细胞密度发酵中的用途。

通过参考随附的示例性附图和随附的权利要求，通过阅读以下详细描述，其它方面和优点对于本领域技术人员将会变得明显。

附图说明

图1：用于绘制manP启动子的转录起始位点的来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的核酸序列，其中腺嘌呤核苷酸处的转录起始位点以高亮标示，推导的-35和-10盒以斜体标示，manR的终点和lys基因的起点以箭头标示，限制性位点BglII、XbaI、AflII和NdeI以下划线标示。

图2：包含manP启动子的启动子区的核酸序列，鸟嘌呤核苷酸处的转录起始位点以高亮标示，推导的-10和-35盒以斜体标示，manR基因的起点以箭头标示，HindIII限制性位点和推定的cre序列以下划线标示。

图3：分别包含于pSUN291、pSUN384.1和pSUN385.2中的获自枯草芽孢杆菌的核酸序列，所述序列包含manR启动子的启动子区，lacZ的起点以箭头标示，限制性位点以下划线标示。

图4：根据本发明的表达载体pSUN279.2的质粒图谱。

图5：包含根据本发明的质粒pSUN279.2、pSUN284.1或pSUN291的枯草芽孢杆菌3NA的β-半乳糖苷酶活性。

图6：获自枯草芽孢杆菌的核酸序列，其包含来自枯草芽孢杆菌的manP启动子的启动子区，包括manR的C-末端，manR与manP之间的基因间区域被报告基因lacZ替换，转录起始位点，-35和-10盒以粗体标示，manR的终点和lacZ的起点以箭头标示，限制性位点以下划线标示。

图7：含有质粒pSUN279.2以及如图6所示的含有不同长度的核酸序列片段的其它质粒的枯草芽孢杆菌3NA的β-半乳糖苷酶活性。

图8：含有具有如图3所示的核酸序列的载体pSUN291、pSUN384.1或pSUN345.2的枯草芽孢杆菌3NA的β-半乳糖苷酶活性。

图9：根据本发明的表达载体pMW168.1的质粒图谱。