[发明专利]用于培养干细胞和祖细胞的方法

说明书

相关申请的引用

本发明要求于2009年6月11日提交的美国临时专利申请号61/186,310以及于2010年4月13日提交的61/323,779的优先权的权益，将其内容以整体引用的方式并入本文。

背景技术

在培养或增殖干细胞、祖细胞、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells)或其它非粘附细胞的领域中存在的问题是如何以一种不干扰之后预期用途的方式培养细胞，包括移植或下游分化。与大多数可粘附于塑料而可在塑料培养烧瓶中培养的细胞不同，干细胞为非粘附性的，因此不能使用传统方法培育。然而干细胞可在成纤维细胞层中生长。这些“饲养细胞”层提供粘附表面并使用迄今未定性的(uncharacterized，未得到特征描述的)干细胞生长和存活所需的生长因子来饲养细胞。最近，研究者能够通过将其连接于衍生自细胞外基质的成分如基质胶(matrigel)来培养干细胞。粘附于这些表面样基质的干细胞必须在含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和聚积的成纤维细胞饲养细胞的分泌物的培养基中进行培养。由于均采用了细胞所分泌的未定性的因子的环境，因此尚不完全清楚如何或为何这些方法促进干细胞增殖。已报道当在基质胶表面培养时，干细胞分化更加迅速。根据任一方法(即饲养细胞或基质胶加上来自饲养细胞的条件培养基)所培养的干细胞均自发地进行分化。分化的干细胞分泌的因子可诱导邻近细胞也开始分化。因此，大约每7天，技术人员必须手动剥离并收获仅看上去未分化的干细胞集落或集落部分。然后将所收获的细胞再平皿培养(re-plated)以继续生长。重复该步骤直到可为预期目的收获足够的未分化细胞。这些培养干细胞的方法是该产业的现有技术水平。

实际上任何类型的干细胞或诱导多能干细胞的扩大培育(scaled up growth)都需要开发新的方法，以实现高生产量地收获这些细胞。

目前的做法是在成纤维细胞饲养细胞上培育干细胞，从中收获的唯一方法是在显微镜下手动剥离以及分离“好”细胞，接着再平皿培养。该步骤是有缺陷的，因为其具有主观性并且耗费时间。所需的是自动化收获的方法和纯化来自混合池(mixed pool)的所需细胞的自动化方法，其中基于分子识别而并非技术人员的主观标准来选择细胞。

培养干细胞的现有方法水平是不够的，因为它们：1)属于劳动密集型；2)本质上与大规模生长不匹配；3)取决于未定性的因素如条件培养基；4)需要细胞或细胞产物将干细胞附着在培养烧瓶上；和5)频繁使用能够不可逆地改变人类干细胞的非人类细胞和细胞提取物。如果可确定能够使干细胞生长的离散因素，将是一个重大的进步。有人认为如果仅加入必需和足够的生长因子，就可以使自发分化最小化。如果能够以一种与大规模生长相容的方式而并非目前在显微镜下手动剥离的方法安全地收获细胞，将是另一个重大的进步。目前，在基质胶上生长的干细胞可通过酶裂解进行收获，例如使用胰蛋白酶。通常，对未分化的集落或集落部分进行手动剥离然后使用诸如胰蛋白酶或胶原酶的酶进行消化。然而，胰蛋白酶会导致大量细胞死亡，并且已报道干细胞在基质胶上连续传代会导致异常核型(染色体组型，karyotype)。这可能是由于使用胰蛋白酶收获或可能由于基质胶是来自小鼠肉瘤细胞的细胞和分泌物的混合物。怀疑非人类饲养细胞会改变所产生的干细胞以使其不完全为人类细胞。例如，怀疑糖基化模式和其它翻译后修饰会呈现饲养细胞物种(species)的特征。

因此，如果开发出支持干细胞生长的无细胞方法，将使现有技术水平得到显著提高。如果能够使用完全定性的离散试剂(discrete agents)培育并收获干细胞，且其中尽可能多的为合成试剂，那么将是更加显著的进步。对于生产适合人类治疗的细胞，如果开发出仅包括可确定的因素的培养细胞的方法，那么将使现有技术水平得到显著提高。理想地，限定的成分应无非人类成分。优选重组蛋白或合成成分。特别优选抗体，包括多克隆、单克隆、人化抗体，其嵌合体或衍生物，由于其产生是高度重现的，其很稳定并可容易地从所收获的细胞中除去，例如使用蛋白A或蛋白G通过亲和去除(affinity depletion)来除去。

发明内容