[发明专利]具有发夹构象的嵌合引物及其使用方法

说明书

本发明公开了用于核酸扩增、检测和基因分型技术的方法和组合物。在一个实施方案中，公开了一种核酸分子，其具有靶标特异性引物序列、靶标特异性引物序列5’的抗标签序列、抗标签序列5’的标签序列以及抗标签序列和标签序列之间的间隔区。本发明还公开了包含所述核酸分子的组合物以及利用所述核酸分子的方法。

发明背景

本申请要求享有2009年6月29日提交的美国临时申请(序列号No.61/221,271)的优先权，其作为整体通过引用并入本文。

技术领域

本发明一般性地涉及遗传学和分子生物学领域。更特别地，本发明涉及用于扩增和检测核酸的方法和组合物。

背景技术

核酸扩增和检测技术是分析DNA样品中的突变和多态性时经常使用的技术。它们还用于对细菌、病毒和真菌(包括感染性病原体)进行检测和分型，这通过分析其DNA或RNA来实现。例如等位基因特异性PCR(allele-specific PCR，AS-PCR)和等位基因特异性引物延伸法(allele-specific primer extension，ASPE)方法利用选定的寡核苷酸引物来检测突变和多态性，所选定的引物允许选择性地实现含有变体核苷酸之序列或含有野生型核苷酸之对应序列的引物延伸。此类方法描述于例如美国专利5,595,890、5,639,611和5,137,806中，其公开内容通过引用并入本文。

美国专利申请(序列号No.12/262,842，其通过引用并入本文)描述了可通过例如上文所述的等位基因特异性引物延伸法(ASPE)和等位基因特异性PCR(AS-PCR)等方法来简化基因分析的方法和组合物。在某些实施方案中，‘842号申请在“一步式”测定方法中使用了在靶标特异性序列的5’具有标签序列的引物，以及包含与引物标签序列互补之抗标签序列的捕获复合物。‘842号申请公开了其一步式扩增和检测法可以将目前市售的LuminexTag-It 技术平台中的多个测定步骤减少为单个步骤。

尽管可以使用上文提及的技术，但是仍需要更好的核酸扩增和检测方法，使其能够提供需要较低程度之引物浓度优化的测定，提供更加快速的 结果，当使用DNA结合染料时具有更低的非特异性背景和更高的特异性信号，提供总体上更为灵敏的检测，更好地代表产物/靶标浓度以及允许更加多重化的引物组。如下文所述，本发明的方法和组合物满足这些要求。

发明概述

本发明的方法和组合物提供了核酸扩增、检测和基因分型技术。在一个实施方案中，本发明提供了一种核酸分子，其包含：靶标特异性引物序列、位于该靶标特异性引物序列5’的抗标签序列、位于该抗标签序列5’的标签序列以及抗标签序列与标签序列之间的间隔区。

在另一实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含：微球、与微球共价连接的第一抗标签核酸、与第一抗标签核酸杂交的标签核酸、共价连接在标签序列3’的间隔区、与第一抗标签核酸序列相同并共价连接在间隔区3’的第二抗标签核酸、共价连接在第二抗标签核酸3’的靶标特异性核酸以及与第二抗标签核酸和靶标特异性核酸杂交的核酸分子(其中该核酸分子包含与抗标签核酸和靶标特异性核酸互补的序列)。

在另一实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含：(a)第一核酸分子，其中所述第一核酸分子是引物对的第一成员，其包含：(i)第一靶标特异性引物序列；(ii)靶标特异性引物序列5’的抗标签序列；(iii)抗标签序列5’的标签序列；和(iv)抗标签序列与标签序列之间的间隔区；以及(b)第二核酸分子，其中所述第二核酸分子是引物对的第二成员，其包含：(i)第二靶标特异性引物序列；(ii)靶标特异性引物序列5’的通用抗标签序列；(iii)抗标签序列5’的通用标签序列；和(iv)抗标签序列与标签序列之间的间隔区；以及(c)第三核酸分子，其包含：(i)与通用标签序列互补的通用抗标签序列；和(ii)标记物。