[发明专利]蛋白质糖基化

说明书

本发明涉及寡糖基(oligosaccharyl)转移酶多肽及其在通过微生物宿主细胞生产糖基化的重组蛋白中的用途，并且包括含有糖基化的重组抗原的疫苗。

介绍

重组蛋白质如酶、多肽激素、重组单克隆抗体和重组抗原的大规模生产要求高标准的质量控制，由于这些蛋白质中许多是给予到人的。此外，疫苗尤其是亚单位疫苗的开发要求生产大量的、不含可以激发过敏反应的污染性抗原的纯蛋白质。在细胞表达系统中重组蛋白质的生产基于原核细胞表达或真核细胞表达进行。当要求对蛋白进行翻译后修饰如糖基化时，后者是优选的。

背景

糖基化是将糖的悬挂基团(pendent group)加到蛋白质、多肽或肽上，其改变所述蛋白质、多肽或肽的活性和/或生物利用度。该过程是共翻译或者翻译后的，并且是酶介导的。存在两种类型的糖基化：对天冬酰胺侧链的N-联糖基化，以及对丝氨酸或苏氨酸氨基酸侧链的O-联糖基化。N-联糖基化是最普通的翻译后修饰并且在真核细胞的内质网上进行。N-联糖基化可以分为两大类；为两个N-乙酰葡糖胺的高甘露糖寡糖和包括其他类型的糖基的复合寡糖。糖基化多肽包含的肽基序为Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸之外的任意氨基酸。其被酶寡糖基转移酶[OT]催化；参见Yan & Lennarz J.Biol.Chem.，Vol.280(5)，3121-3124(2005)OT catalyzes the transfer of an oligosaccharyl moiety(Glc3Man9GlcNAc2)from the dolichol-linked pyrophosphate donor to the side chain of an Asn。对于所有的N-联寡糖而言，五糖核心是共有的并作为许多N-联寡糖的基础。O-联糖基化较不常见。丝氨酸或者苏氨酸残基通过其侧链氧通过糖苷键与糖连接。通常地，N-乙酰葡糖胺是以此方式与细胞内蛋白质相连的。

最近才认识到原核细胞具有将蛋白质糖基化的能力。尤其地，认识到了在一些ε蛋白菌中存在N-联糖基化。例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)[C.jejuni]的基因组编码脂寡糖和N-联糖蛋白的合成中牵涉的基因。蛋白质糖基化位置[pgl位置]牵涉到30个以上的糖蛋白的糖基化中。还证明了所述的pgl基因可以在大肠杆菌[E.coli]中发挥功能从而修饰共表达的空肠弯曲杆菌蛋白质，这说明大肠杆菌可以被改造从而产生异源重组糖蛋白。由空肠弯曲杆菌基因座编码的PglB可以将包括细菌O-抗原的替代多糖转移到成熟的N-联七糖GalNac5GlcBac，这暗示宽松的特异性。然而，有与此酶相关的问题；所述的酶并不能够转移所有的多糖。这可以是由在多糖的还原性末端的糖的C2位上需要乙酰氨基基团所导致的。因此希望能鉴定替代的无此障碍的寡糖基转移酶。

在药物的历史上最重要的发现之一是接种策略的开发，所述的接种策略用于针对大量的感染性和非感染性的疾病，为人和动物提供保护。多种疫苗是由注射到个体中的灭活或减毒的病原体制备的。这些有时候可以引起不良的副作用。多种现代疫苗是由病原体的保护性抗原制备的，其通过纯化或分子克隆从引起副作用的物质中分离。这些后者的疫苗称作“亚单位疫苗”。由荚膜细菌引起的细菌性感染是全世界主要的健康问题。由于主要表面抗原荚膜多糖的T细胞非依赖性的本质，难以针对肺炎链球菌(Streptoccocus pneumoniae)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)菌种进行接种。关于有效疫苗的开发，T细胞非依赖性抗原如荚膜多糖表现出特别的问题。抗体的产量低，并且一般地在再次免疫中不被加强。抗体同种型被限制为IgM，而其他同种型对特异性抗原一般具有低的亲和性。主要问题在于幼童对T细胞非依赖性疫苗的应答。这些个体对于细菌感染是最脆弱的。

T细胞依赖性抗原在引发高滴度、高亲和性的抗体应答中更为有效，并且通常是蛋白质。这是由于对B-淋巴细胞有帮助的T-淋巴细胞在对这些抗原的免疫应答中被引发。B-淋巴细胞通过其特异性抗原受体结合于抗原，这导致了部分激活。如果所述的抗原是蛋白质的话，所述的B淋巴细胞摄取并加工该抗原成为肽，所述的肽是与HLA II类分子在细胞表面上表达的。T细胞非依赖性抗原在组成上不总是蛋白质，并且因此不能由B-淋巴细胞通过HLA分子进行加工和呈递。该抗原呈递的失败使得该抗原的T-细胞识别低，并且因此导致其无T细胞辅助。