[发明专利]用于对模板DNA进行复制、扩增和测序的方法

权利要求书

1.用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，所述方法包括使所述DNA与包含至少以下的反应混合物接触：

a)φ29型DNA聚合酶；

b)聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦；

c)铵盐；

d)缓冲液；

e)氯化镁；

f)引物；和

g)核苷三磷酸。

2.权利要求1的方法，其中所述反应混合物还包含钾盐。

3.权利要求2的方法，其中所述钾盐为氯化钾或乙酸钾。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的0.003％-0.1％。

5.权利要求4的方法，其中所述聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的0.006％-0.05％。

6.权利要求5的方法，其中所述聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的0.01％-0.03％。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述铵盐选自：硫酸铵、氯化铵或乙酸铵。

8.权利要求7的方法，其中所述铵盐为硫酸铵。

9.权利要求8的方法，其中所述硫酸铵的浓度为30mM-60mM。

10.权利要求9的方法，其中所述硫酸铵的浓度为40mM-50mM。

11.权利要求7的方法，其中所述铵盐为氯化铵或乙酸铵。

12.权利要求11的方法，其中所述氯化铵或乙酸铵的浓度为60mM-120mM。

13.权利要求12的方法，其中所述氯化铵或乙酸铵的浓度为80mM-100mM。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述φ29型DNA聚合酶选自分离自以下噬菌体的DNA聚合酶：φ29、Cp-1、PRD-1、φ15、φ21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、GA-1、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、L17或ABV。

15.权利要求14的方法，其中所述φ29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的氨基酸序列。

16.权利要求15的方法，其中所述φ29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。

17.权利要求16的方法，其中所述φ29型DNA聚合酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。

18.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述φ29型DNA聚合酶在核酸外切酶结构域中具有修饰，其中所述经修饰的DNA聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶相比具有小于10％的核酸外切酶活性。

19.权利要求18的方法，其中所述经修饰的φ29型DNA聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶相比具有小于1％的核酸外切酶活性。

20.权利要求19的方法，其中所述经修饰的φ29型DNA聚合酶相对于相应的天然存在的DNA聚合酶缺乏可检测的核酸外切酶活性。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述缓冲液为tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES。

22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述缓冲液的pH为7-8.5。

23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述氯化镁的浓度为2mM-20mM。

24.权利要求23的方法，其中所述氯化镁的浓度为5mM-15mM。

25.权利要求2-24中任一项的方法，其中所述氯化钾或乙酸钾的浓度为30mM-70mM。

26.权利要求25的方法，其中所述氯化钾或乙酸钾的浓度为40mM-60mM。

27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述核苷三磷酸为dCTP、dGTP、dTTP和dATP。

28.权利要求27的方法，其中所述dCTP、dGTP、dTTP和dATP核苷三磷酸为等摩尔量。