[发明专利]用于对模板DNA进行复制、扩增和测序的方法

说明书

本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种使用φ29型DNA聚合酶对脱氧核糖核酸进行复制、扩增或测序的方法和一种用于实施所述方法的试剂盒。

现有技术水平

噬菌体φ29复制其基因组所需要的唯一酶是其DNA聚合酶，这是既能催化复制起始又能催化合成链延伸的66KDa的单体蛋白。对于起始，该聚合酶与称为“末端”(TP)的蛋白质结合，识别φ29DNA的末端并催化TP-dAMP共价复合物形成。在聚合了10个核苷酸后，DNA聚合酶/TP异二聚体解离，并延伸来自DNA的链。

复制性DNA聚合酶需要与稳定酶和DNA间的结合的辅助蛋白相互作用(Kuriyan和O′Donnell.J Mol Biol.1993；234：915-925)。另一方面，所述DNA聚合酶必须在当时未被复制的DNA链分离时偶联聚合，为此它们需要与解旋酶型蛋白的功能缔合。在这方面，噬菌体φ29的DNA聚合酶具有以下使其独特的各种内在功能特性：

a)高持续合成能力(定义为通过结合事件掺入的核苷酸数目)；

b)高链分离能力，这使得其可在不存在解旋酶型辅助蛋白时复制所述噬菌体的基因组。持续合成能力和链分离这两个特性使得φ29DNA聚合酶能够合成超过70kb长的DNA链(Blanco等，J Biol Chem.1989；264：8935-8940)；

c)在新链中插入核苷酸的高准确性(Esteban等，J Biol Chem.1993；268：2719-2726)。

所有这些特性导致开发各种各样基于使用该聚合酶扩增双链DNA(dsDNA)的等温过程(恒温)方案。在简单构型中，φ29DNA聚合酶利用环状单链DNA(ssDNA)的能力使得可通过滚环式方法(或RCA-滚环式扩增)扩增DNA，产生很长的含有不止10个环状模板拷贝ssDNA分子(Blanco等，J Biol Chem.1989；264：8935-8940；US5001050，US5198543和US5576204)。在由Amersham Biosciences/Molecular Staging(Dean等，Genome Res.2001；11：1095-1099；Dean等，Proc Natl Acad Sci USA.2002；99：5261-5266)开发的用于扩增dsDNA的方法中，将使用φ29DNA聚合酶与使用六聚物(六-核苷酸)随机序列引物联合，使得能够从皮克级环状质粒DNA[GE Healthcare的Templiphi^TM]或从10纳克基因组DNA[GE Healthcare的Genomiphi^TM和Qiagen的Repli-G]开始获得10⁴-10⁶扩增因子。产生的产物具有高质量，并可直接被消化或测序而不需在前纯化，这证明了φ29DNA聚合酶是用于该目的的最强的酶。用于实施使用φ29DNA聚合酶的扩增反应的常见缓冲液含有tris-HCl(pH 7.5)加不同浓度(毫摩尔级)的NaCl或KCl和MgCl₂(US20030207267)。然而，尽管这些方案在多种情况下令人满意，但仍日益需要开发允许从更少DNA量开始的其它方案。

发明简述

本发明涉及一种使用φ29型DNA聚合酶对脱氧核糖核酸进行复制、扩增或测序的方法和一种用于实施所述方法的试剂盒。

噬菌体φ29DNA聚合酶具有非常令人感兴趣的用于扩增DNA的几个特点，例如：无需任何辅助蛋白参与的高持续合成能力；和高链分离能力，这使得其可在与DNA单一结合事件中复制所述噬菌体的基因组；以及在新链中插入核苷酸的高准确性。这些特性导致开发各种各样基于使用该聚合酶的用于等温扩增DNA的方案，该聚合酶使得能够获得不需在前纯化就可被直接消化或测序的高品质产物。然而，仍需要允许从其更小量扩增DNA的方案。本发明通过开发显著改进反应的特异性和产量的用于扩增DNA的方法来响应该需要。

在本专利实施例中显示，将聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦(Tween20)和铵盐同时加入通常用于用φ29DNA聚合酶来扩增的缓冲液中，一方面防止非特异性DNA扩增，另一方面使得能够从有限量的0.1飞克(fg)的质粒DNA和作为模板的10fg基因组DNA实现可检测的特异性扩增。

本发明第一方面涉及一种用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，所述方法包括使所述DNA与包含至少以下的反应混合物接触：