[发明专利]增加的转基因表达和加工的产品和方法

权利要求书

1.一种转基因表达的方法，包括：

(a)提供真核生物，优选哺乳动物的宿主细胞，其中所述宿主细胞已被修饰或处理以在所述细胞中增加同源重组(HR)，降低非同源末端连接(NHEJ)和/或提高HR/NHEJ比，和

(b)用至少一种包括所述转基因的载体，并任选地，用基质附着区(MAR)元件，转染所述细胞，其中所述MAR元件以顺式或反式提供给所述转基因。

2.权利要求1所述的方法，其中(b)中所述的转染是随后的转染，并在用核酸如载体或核酸片段的最初的转染之后。

3.权利要求2所述的方法，其中所述细胞的细胞群体的细胞周期被同步。

4.权利要求2或3所述的方法，其中所述最初和随后的转染每次发生在当所述群体的多数所述细胞在所述细胞周期的G1期时。

5.权利要求4所述的方法，其中所述细胞群体的大于30％、大于31％、32％、33％、34％、35％、36％、36％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％或45％的所述细胞处于G1期。

6.权利要求3和之后权利要求中任一个所述的方法，其中通过使所述细胞群体经受化学或温度处理，所述细胞周期被同步。

7.权利要求2或之后权利要求中任一个所述的方法，其中在所述初始转染之前给予所述细胞HR酶、HR激活剂和/或NHEJ抑制剂。

8.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述细胞是重组的真核宿主细胞并包括编码HR酶、HR激活剂和/或NHEJ抑制剂的转基因序列和/或其中所述细胞的NHEJ或HR基因被突变。

9.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述细胞是重组的真核宿主细胞，并且所述细胞的基因组被突变以使NHEJ失活，以增加至少一个HR酶、至少一个HR激活剂和/或至少一个NHEJ抑制剂的表达或活性。

10.权利要求2或之后权利要求中任一个所述的方法，其中所述最初转染的核酸是至少一个包括转基因的载体，其中所述最初转染的所述至少一个所述载体和所述至少一个随后转染的至少一个载体在整合进所述细胞基因组之前和/或之后形成串联结构。

11.权利要求10所述的方法，其中所述最初转染的至少一个载体和所述随后转染的所述至少一个载体形成整合进所述细胞基因组的串联结构，其中所述串联结构包括所述转基因的至少200、300、400、500或600个拷贝。

12.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述细胞的所述HR/NHEJ比比分别不包括所述转基因序列和未被突变的细胞中发现的比高达2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍，或其中所述NHEJ活性等于0。

13.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述至少一个随后的转染之后，整合进所述细胞基因组的所述转基因的整合拷贝数比代表通过用(b)所述的载体直接转染所述细胞获得的整合拷贝数的参考值大两倍。

14.权利要求2和随后的权利要求中任一个所述的方法，其中所述至少一个最初转染是单一转染。

15.权利要求14所述的方法，其中所述最初转染的所述核酸是包括MAR元件和所述转基因的载体，其中，所述最初转染之后，所述转基因的表达达到最初的水平，其中，所述随后的转染之后，所述转基因的表达达到随后的水平，该水平超过累加的，优选，单个随后的转染之后，超过所述最初水平的两倍、三倍或四倍。

16.权利要求14所述的方法，其中(a)中的所述核酸是包括MAR元件和所述转基因的载体，其中，所述最初转染之后，整合进所述细胞基因组的所述转基因拷贝数等于(n)，其中，至少一个随后的转染之后，整合进所述基因组的所述转基因拷贝数大于2(n)、3(n)或4(n)。

17.权利要求15或16所述的方法，其中所述至少一个随后的转染是单一转染。

18.权利要求15或16所述的方法，其中所述转基因作为串联结构在单个基因座被整合进所述细胞的基因组。

19.以上权利要求中任一个所述的方法，其中(b)中的所述MAR元件改善表达，基本上或完全防止来自包括所述转基因的载体的多重拷贝的共整合的抑制效应。