[发明专利]增加的转基因表达和加工的产品和方法

说明书

相关申请的交叉引用

该申请要求2009年9月18日提交的美国临时申请号61/243,950的权益，其以其全部通过引用被并入本文。

发明领域

本发明涉及用于转基因表达的方法和真核宿主细胞。通过偏爱同源重组(HR)超过非同源末端连接(NHEJ)，转基因表达被推进。本发明还涉及在非灵长类真核宿主细胞中提供在灵长类，特别是人类中涉及的蛋白质，介导或影响跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌的途径。

发明背景

治疗性蛋白的生物技术产生以及基因和细胞疗法取决于导入到真核细胞中的转基因的成功表达。成功的转基因表达常常要求转基因整合进宿主染色体并受整合的转基因拷贝数目的限制和受外遗传效应等的限制，外遗传效应可引起低的或不稳定的转录和/或高克隆变异性。转基因表达产物不能或降低的转运出细胞也常常限制治疗性蛋白的产生以及基因和细胞疗法。

出版物和其它材料——包括本文中用于说明本发明，特别是用于提供关于实施的另外细节的专利和登录号——以其全部通过引用被并入本文。为方便起见，在下文中出版物通过作者和日期被引用并在文献目录中按作者字母顺序列出。

真核生物的DNA被高度压缩成染色质的事实允许全部真核基因组在几微米直径的细胞核内适合。然而，该事实使得基因表达通过染色质的局部和暂时的压缩和解压缩而被控制，其包括高度调节的和复杂的细胞结构。此外，转基因整合进宿主染色体在大多数情况下是随机事件，其导致随机的整合位置和变化的拷贝数。通常在稳定的转基因表达中观察到的独立转化体中的高度变异性被认为依赖在宿主基因组内整合的转基因拷贝数目并依赖在转基因整合位点的染色质环境(Kalos and Fournier，1995；Recillas-Targa et al.，2002)。整合进随机位置的转基因的表达可受在整合位置的调控元件的任意存在的影响以及受与整合位置相邻的染色体结构域的染色质结构影响。例如，由于活性基因靠近抑制性异染色质，被称作位置效应变化的现象可引起活性基因随着时间沉默(Robertson et al.，1995；Henikoff，1996；Wakimoto，1998)。

已发展了很多方法，如磷酸钙DNA共沉淀、聚乙稀亚胺法、电穿孔和聚阳离子脂质来促进具有可变的转染率的基因转移。扩大转基因拷贝数并因此增加转基因表达的一个方法是基因扩增(Kaufman，2000)。可选的方法是通过插入合成的或天然调节序列来优化表达载体。

为了增加和稳定在哺乳动物细胞中的转基因表达，外遗传调节子正日益增加地用于保护转基因抵御负位置效应(Bell and Felsenfeld，1999)并包括边界或绝缘子元件、基因座控制区(LCRs)、稳定和抗阻抑物(STAR)元件、无所不在地作用染色质开放(ubiquitously acting chromatin opening)(UCOE)元件和上述的基质附着区(MARs)。所有这些外遗传调节子已用于哺乳动物细胞系中重组蛋白质产生(Zahn-Zabal et al.，2001；Kim et al.，2004)并用于基因疗法(Agarwal et al.，1998；Allen et al.，1996；Castilla et al.，1998)。

如上所述，失败或降低的转基因表达产物转运出细胞还常常限制治疗用蛋白质的产生以及基因和细胞疗法。转基因表达产物常常遇到不同的瓶颈：只装备有处理和转运细胞固有蛋白质的结构的细胞才能通过某些类型的转基因表达产物转运而变得容易地过多装载，尤其是当转基因表达产物以如通常期望的异常高的水平产生，使产物聚集在细胞内和/或，例如，防止功能蛋白质产物的正确折叠时。