[发明专利]用于检测染色体非整倍性的方法

说明书

引用的相关申请

本申请要求2009年8月11日提交的美国临时专利申请第61/233,042号和2010年2月26日提交的美国临时专利申请第61/308,578号的优先权，出于各种目的，每个专利申请的内容通过引用全文并入本文。

发明背景

根据医院和医学专业人员目前使用的各种方法，在妊娠期间可以检测各种遗传疾病，例如染色体非整倍性。然而，这些方法中的大多数是侵入性的，并且具有意外的胎儿丢失或流产的风险。使用母体血浆中的胎儿DNA进行染色体非整倍性的非侵入性产前诊断，是一个得到积极研究的领域，并且明确需要新的和更为可靠的早期检测方法。本发明提供了通过胎儿特异性的表观遗传标志物和遗传标志物的组合来检测染色体非整倍性(例如21三体)的新方法。

具体而言，使用包括联合亚硫酸氢盐限制性分析和甲基化DNA的免疫沉淀的方法，然后使用覆瓦式阵列(tiling array)杂交(MeDIP-芯片)，以及用亚硫酸盐测序确认任何靶基因座，本发明人搜索了染色体21、18、和13上在胎盘和母体血细胞中差别甲基化的胎儿DNA标志物。使用甲基化敏感的限制性核酸内切酶消化，之后使用实时聚合酶链式反应(PCR)或微流体数字PCR分析，对得到的标志物进行了分析。通过比较这些表观遗传标志物与遗传标志物的剂量，进行了染色体剂量分析，所述遗传标志物为源自胎儿且能够通过其独特的多核苷酸序列与母体DNA序列相区分的DNA序列。此类遗传标志物的一个实例是存在于Y染色体上的锌指蛋白Y连锁(ZFY)基因。

例如，发现全羧化酶合成酶(HLCS)基因的推定启动子在胎盘中高甲基化，而在母体血细胞中低甲基化。使用高甲基化HLCS和ZFY基因座进行的染色体剂量比较可以区分21三体和整倍体胎盘DNA样品。本发明人证实，表观遗传-遗传染色体剂量方法是用于非侵入性母体检测染色体非整倍性的新方法，所述染色体非整倍性例如21三体(T21)、18三体(T18)、或13三体(T13)。利用涉及于染色体非整倍性的任何染色体上的表观遗传标志物，该方法提供了一种用于非侵入性产前诊断的普遍可用技术。

发明概述

本发明提供了用于检测孕妇怀有的胎儿中的染色体非整倍性的方法。所述方法包括下述步骤：(a)测定取自所述孕妇的生物样品中胎儿来源的甲基化标志物的量，其中所述甲基化标志物位于与染色体非整倍性相关的染色体上或位于与染色体非整倍性相关的染色体的区段内，并且其中所述胎儿来源的甲基化标志物由于DNA差别甲基化而与其母体来源的对应物相区分；(b)测定所述样品中胎儿来源的遗传标志物的量，其中所述遗传标志物位于参照染色体上，并且其中所述胎儿来源的遗传标志物由于多核苷酸序列的差别而与所述样品中其母体来源的对应物相区分，或所述遗传标志物不存在于所述母体基因组中；(c)测定来自(a)和(b)的所述量的比率；以及(d)将所述比率与标准对照进行比较，其中所述比率高于或低于标准对照指示了胎儿中存在染色体非整倍性。通常，标准对照值近似人基因组中预期的基因或染色体的剂量或比率，但是取决于检测方法中使用的具体方法学，可能存在微小变化。例如，在整倍体男性基因组中，存在2个拷贝的染色体21和1个拷贝的Y染色体。因此，染色体21上的表观遗传标志物与Y染色体上的遗传标志物之间的剂量比率可能是大约2。

在一些情况下，所述胎儿来源的甲基化标志物来自胎盘。在其它情况下，所述母体来源的对应物来自孕妇的血细胞。所述胎儿来源的甲基化标志物可以比其母体来源的对应物甲基化程度高，或它可以比其母体来源的对应物甲基化程度低。

在一些情况下，所述样品是母体全血、血清、血浆、尿液、羊水、生殖道灌洗液、胎盘组织样品、绒毛膜样品、或含有分离自母体血液的胎儿细胞的样品。在其它情况下，所述样品是含有胎儿核酸的任何样品。