[发明专利]产生对多种肿瘤抗原或多种病毒特异的CTL细胞系

说明书

相关申请的交叉参考

本发明要求2009年8月24日提交的美国临时专利申请系列第61/236,261号的优先权，其通过引用全文纳入本文。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明在NIH-NCI资助的P50 CA126752下由政府支持完成。政府对本发明拥有某些权利。

技术领域

本发明一般涉及细胞生物学、免疫学、分子生物学和医药领域。在具体实施方式中，本发明一般涉及癌症免疫治疗。

发明背景

预防和/或治疗免疫受损宿主中的病毒感染的多病毒特异T细胞

病毒感染造成所述免疫受损宿主如接受异源干细胞移植(SCT)的患者的显著发病率和死亡率。由持续性疱疹病毒如EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒，以及由呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒、副流感病毒和流感病毒引起的感染已熟知，而近期更理解了由腺病毒(Adv)、BK病毒和人疱疹病毒6引起的感染的重要性(Kim等，2007；Myers等，2007；Kadakia等，1996；Comoli等，2006；de Pagter等，2008)。尽管药物试剂是一些感染的标准疗法，但其有显著的毒性、生成抗性变体且经常无效。

恢复病毒特异性免疫的免疫治疗策略提供了有吸引力的治疗替代法。已用EBV转化的类淋巴细胞系(EBVLCL)作为抗原来源制备了源于供体的EBV特异细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，且异基因造血SCT(HSCT)(Heslop等，1996；Comoli等，2007)(Heslop等，2010)后输注这些细胞系以最小的毒性阻止并治疗了EBV驱动的B细胞淋巴增殖性疾病(EBV-LPD)(Cruz等，2010)。

相似地，用CMV肽、裂解物或载体转导的抗原呈递细胞(APC)生成的过继转移性供体衍生CMV特异CTL能重建针对该病毒的免疫应答并保护患者抵御CMV疾病的发展或之后复发(Riddell等，1992；Walter等，1995；Einsele等，2002a；Einsele等，2002b；Peggs等，2003；Micklethwaite等，2008；Micklethwaite等，2007)。最近，通过用表达CMV-pp65的嵌合腺病毒载体作为转基因遗传修饰单核细胞和EBV-LCL来生成靶向EBV、CMV和Adv的三病毒(trivirus)反应性CTL。

输注到HSCT受体中后，少至2×10⁵/kg的三病毒特异CTL增殖数个数量级且看来会保护所述受体抵御由所有三种病毒产生的疾病(Leen等，2006)。虽然有这些振奋人心的临床结果，T细胞免疫治疗的广泛实施受到以下限制：(i)生成CTL通常需要的所述感染性病毒材料(EBV/CMV/Adv)，(ii)制造用于抗原呈递的临床级别载体的成本，和(iii)消除同种异源反应性T细胞需要的长时间培养(10-12周制造过程)，和其随之对技术技能和时间的需求。为了解决所述后期问题，一些小组评价了更快速的选择抗原特异性T细胞的方法。

使用人白细胞抗原(HLA)肽四聚体然后用磁珠选择，Cobbold和同事选择了来自干细胞移植供体血液的CMV特异CD8+T细胞，并观察到将极少数量的所选细胞输注后给人深刻印象的临床反应，9个治疗患者中有8个清除了感染(中值8.6 x 10³/kg)(Cobbold等，2005)。暴露于抗原后选择分泌干扰素γ(IFN-γ)的T细胞(IFN-γ捕获试验)也用于临床，Feuchtinger和同事在用病毒肽体外刺激后直接从外周血中具体选择了Adv特异T细胞并表明少量细胞(1.2-50 x 10³/kg)在体内安全、有保护性且有效(Feuchtinger等，2004；Feuchtinger等，2006)。然而，这些方法都昂贵且需要大体积的起始血液，其通常难以获取，特别是在非血缘关系匹配供体的设定中。四聚体试剂受到已知的表位和CD8选择的限制。γ捕获限制分泌γ干扰素的T细胞的输注。可能缺失具有其他功能的抗原特异T细胞。迄今为止，其使用受到紧急医疗需求的约束情况的限制。

本领域需要替代的符合实施的良好制造方法，其能克服所有三种限制(体积、时间和感染性试剂)以从少量血液体积中快速生成多病毒特异CTL用于免疫治疗目的。本发明提供如何用编码免疫优势和次优势病毒抗原的DNA质粒核转染树突细胞(DC)以及将其用作体外T细胞刺激物以生成多病毒反应性CTL，所述CTL在10天内靶向来自多种常见病毒的抗原中的多种不同表位(Gerdemann等，2009)。