[发明专利]用于检测幽门螺杆菌和/或克拉霉素抗性特征的肽核酸探针，试剂盒和方法及应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及临床关联微生物的检测方法和抗生素抗性特征领域。开发4种肽核酸探针(PNA)以检测存在对克拉霉素的应答(抗性/感受性)的幽门螺杆菌(H.pylori)和/或株。

本发明的另一方面涉及将这些探针及所述检测方法应用到用于在生物学样品中幽门螺杆菌(H.pylori)的克拉霉素抗性的检测的试剂盒，由此具有临床应用。

【背景技术】

幽门螺杆菌(H.pylori)是定居人胃粘膜的病原性细菌，相关于胃感染诸如慢性胃炎，消化性溃疡，萎缩性胃炎和胃癌。

幽门螺杆菌(H.pylori)感染可基于侵袭性方法，诸如胃活组织检查(内窥镜检查)，或非-侵袭性方法诸如脲呼吸测试，血清学测试或粪便抗原测试来诊断。后者更频繁地用于临床实践，因为它们对于患者不太昂贵和更方便。

最通常使用的测试/试剂盒可检测特定幽门螺杆菌(H.pylori)酶，脲酶(US200306856和EP0920531)。但是，由于在标准方法中存在的敏感度/特异性的缺乏，在更细节化的诊断中仍优选使用侵袭性方法。

实际上，用内窥镜活组织检查，可能使用基于培养的测试，诸如E-测试和琼脂稀释方法或通过基于PCR(聚合酶链反应)的分子方法获得更可靠的关乎幽门螺杆菌(H.pylori)存在的信息。但是，第1是苛刻和耗时，第2是需求一些额外护理以避免可能的可导致假阳性或假阴性的DNA污染。

近来，开发出肽核酸探针(PNA)并优化用于细菌检测。PNA分子是其带负电的糖-磷酸主链结构被由重复的(2-氨基乙基)甘氨酸单元形成的非手性及电中性取代的DNA模拟物。

尽管，PNA分子缺乏戊糖，PNA和互补DNA序列之间的特异性杂交可通过氢键合发生，遵从Watson-Crick规则。

相比传统上使用的典型DNA探针，PNA的电中性性质有助于PNA和靶序列(rRNA和双链DNA)之间的更稳健的杂交。由于其高亲和性，PNA探针具有相对较短的核苷酸序列(8～17个核苷酸)。DNA探针通常具有至少18个核苷酸，由于其弱稳定性及更低熔解温度(Tm)，需要用酶和其他剂的额外的固定和渗透化过程。相比DNA分子，PNA分子提供对于蛋白酶和核酸酶的更高抗性。

PNA探针可通过显微镜检或流式细胞术，当附接于荧光色素时通过荧光原位杂交技术(FISH)检测。

与传统培养方法比较，此技术在临床样品中产生更迅速结果，也有改善的功效，敏感度和特异性。其提供广范围的应用和可应用于不同微生物学领域，诸如在人，环境和食品样品中的微生物检测。

已设计并公开/授专利权用于临床微生物，诸如沙门氏菌属(Salmonella)，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，非金黄色葡萄球菌(Staphylococcus non-aureus)物种，人乳头瘤病毒属(Papillomavirus)，及念珠菌属(Candida)的检测的探针的一些例显示此技术的增加的兴趣。

已可利用用于幽门螺杆菌(H.pylori)的特异性检测的PNA探针(Azevedo N.F.等人，2003)。而且，要求了另一探针的专利(WO2008155742-A2；PT103767-A1)。后者显示相当地高特异性和敏感度，盖过使用的标准方法N.等人，2007)。尽管幽门螺杆菌(H.pylori)检测重要，期望鉴定幽门螺杆菌(H.pylori)抗生素抗性，其不可能使用仅上述探针检测。

实际上，最通常使用的用于幽门螺杆菌(H.pylori)根除的治疗是三重治疗，其包含质子泵抑制物和2种抗生素(例如克拉霉素，甲硝唑，阿莫西林)持续7～14天。此治疗可对患者导致不适，由于抗生素过度利用及它们可导致的次级效应。

此外，此治疗的成功被幽门螺杆菌(H.pylori)对克拉霉素(在这些情况中使用的优秀的抗生素)的抗性的增加所阻碍。目前，克拉霉素抗性通过培养方法或PCR检测，但这些方法与用于幽门螺杆菌(H.pylori)检测的那些及以上描述的具有相同的限制。因此，由于迅速，可靠的和实践方法的缺乏，在治疗开始之后或在已证明其无效之后通常获得幽门螺杆菌(H.pylori)的各株的克拉霉素抗性。本发明描述抗性株鉴定的可靠的，实践的和稳健的应用，及提供对患者的充分的治疗选择，免公害，风险，治疗时间，及成本的显著贡献。