[发明专利]脑膜炎球菌fHBP多肽的表达

说明书

本申请要求2009年9月30日提交的美国临时申请61/247,428的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及蛋白质表达领域，具体涉及奈瑟球菌H因子结合蛋白(fHBP)的表达。

背景技术

脑膜炎奈瑟球菌是革兰阴性的有荚膜细菌病原体。在开发对抗血清组B脑膜炎球菌的广谱疫苗中一种感兴趣的抗原是fHBP，也称为蛋白质‘741’[1]、‘NMB1870’、‘GNA1870’[2-4]、‘P2086’、‘LP2086’或‘ORF2086’[5-7]。这种脂蛋白在所有脑膜炎球菌血清组中表达，并在多种菌株中发现。已将fHBP序列分为三个家族[2](在本文中称为家族I、II和III)，又给定家族产生的血清对同一家族产生杀细菌活性，但对表达其它家族之一的菌株无活性，即存在家族内、而非家族间交叉保护。

对于疫苗接种目的，fHBP蛋白已用作大肠杆菌(E.coli)中表达的重组蛋白[8]或已经在脑膜炎球菌中过度表达，以至于从过度表达菌株中纯化的外膜囊泡将展示大量免疫原性fHBP[9]。然后，这些囊泡可用于疫苗，以提供强大的保护性抗-fHBP应答。

本发明的一个目的是提供提高脑膜炎球菌中fHBP表达的额外的改良方法。

发明内容

本发明人发现，fhbp基因由两种差异调控的启动子从两种独立转录物表达。在一个转录物中，它与相邻上游基因(nmb1869)由P_nmb1869启动子共同表达。另一转录物是单顺反子，并由其自身专用启动子P_fhbp表达，它由全局调控蛋白FNR(已知的厌氧激活物蛋白质、延胡索酸和硝酸还原酶调节物)因氧限制条件而激活。为了提高单顺反子转录物的表达，采用FNR的突变形式。该突变形式是组成型活化的，甚至在有氧条件下也是如此，因此内源性P_fhbp启动子组成型激活，导致fHBP过度表达。可采用相同方法过度表达任何其它具有FNR激活的启动子的脑膜炎球菌基因，包括经工程改造处于这种启动子控制下的基因。

因此，本发明提供一种脑膜炎球菌，其(a)具有其转录处于FNR激活的启动子控制下的基因，和(b)表达FNR的组成型活性形式。FNR的表达导致FNR活化基因的组成型表达。转录处于FNR激活的启动子控制下的基因最好是fhbp基因。虽然不是必需，但脑膜炎球菌最好不表达FNR的非组成型活性形式。

本发明也提供一种制备脑膜炎球菌突变体的方法，该方法包括修饰其内源性fnr基因的步骤，以使编码的FNR蛋白组成型活化。

本发明也提供一种制备脑膜炎球菌突变体的方法，该方法包括引入编码FNR的组成型活性形式的基因的步骤。该方法也可包括修饰脑膜炎球菌中任何内源性fnr基因的步骤以抑制或防止其表达。

因此，本发明还提供一种提高转录物表达的方法，该转录物在脑膜炎球菌中的转录受FNR激活的启动子控制，该方法包括为脑膜炎球菌提供FNR的组成型活性形式。然后，转录物表达增加可提高脑膜炎球菌中编码蛋白的水平。

因此，本发明还提供一种在脑膜炎球菌中提高转录物表达的方法，该转录物含有其表达受至少两个不同启动子控制的基因，这两个启动子中一个是FNR激活的启动子，另一个不是，所述方法包括向所述脑膜炎球菌提供FNR的组成型活性形式，从而提高该转录物的表达。在包含该基因的多种转录物中，相对于不同启动子驱动的转录物，FNR活化启动子驱动的转录物增加。

本发明还提供一种制备脂蛋白体脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包括处理本发明脑膜炎球菌的步骤，以破坏其外膜，从而由其形成包含外膜的蛋白质组分(如fHBP)的囊泡。所述囊泡可用作免疫原性组合物中的免疫原性组分(例如，作为对抗脑膜炎球菌的疫苗)。该方法可包括从任何活的和/或完整的细菌分离囊泡的又一步骤，例如，通过大小分离(如过滤，使用允许囊泡通过但不允许完整细菌通过的滤器)，或通过离心以使细胞相对于囊泡优先沉淀(例如低速离心)。

本发明还提供一种制备免疫原性组合物(如疫苗)的方法，该方法包括将由上述囊泡制备方法制备的囊泡与药学上可接受的运载体(如缓冲液)和/或免疫佐剂和/或一种或多种其它免疫原性组分配制在一起的步骤。

本发明还提供表达FNR的组成型活性形式的脑膜炎球菌。

本发明还提供脑膜炎球菌FNR的组成型活性形式，此外还提供编码这一FNR的核酸。