[发明专利]用于哺乳动物来源的神经胶质限制性祖细胞的扩增、鉴定、表征和效能增强的方法和组合物

说明书

本专利申请要求2010年4月22日提交的序列号为61/326,799的美国临时申请和2009年11月12日提交的序列号为61/260,441的美国临时申请的优先权益，所述每个临时申请的教导内容在此以其全文引为参考。

技术领域

本发明提供了用于制造哺乳动物来源的神经胶质限制性祖细胞（GRP）群的方法，以及使用这些细胞的方法，所述细胞群具有减少的可能不想要的细胞表型和/或降低的群细胞中的标准偏差。在本发明中还提供了用于表征GRP的抗体组及其在表征GRP细胞中的使用方法。

背景技术

神经胶质限制性祖细胞（GRP）由它们与抗体A2B5的反应性来确定，所述抗体识别c-系列神经节苷脂亚组（Dietrich等，Glia 200240:65-77；Rao和Mayer-Proschel,Dev.Biol.1997188:48-63；Saito等，J.Neurochem.2001 78:64-74；Windrem等，Nat.Med.2004 10:93-97）。GRP的其它抗原性特征包括星形细胞标志物胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的中度表达和神经元标志物E-CAM（多唾液酸化N-CAM或PSA-NCAM）和β-III微管蛋白（TuJ1）的低表达（Dietrich等，Glia 200240:65-77；Rao和Mayer-Proschel,Dev.Biol.1997 188:48-63）。

在GRP被分离时，它们已经内源性分化至超出神经干细胞的范围，成为定型的谱系限制性细胞。尚未观察到GRP诱导或产生畸胎瘤。

脑和脊髓中非常重要的一类神经元包括那些轴突被包裹在髓磷脂中的神经元。当该髓鞘受损时，其生命过程构成神经元轴突周围的绝缘性髓磷脂层的少突神经胶质细胞被破坏。脱髓鞘的神经元不能正确传导信号，并最终将死亡。

当损坏不完全时，内源性修复机制被激活，引起髓鞘重新形成和功能部分或完全恢复（Lassmann等，Mult.Scler.1997 3:133-136；Prineas和Connell,Ann.Neurol.1979 5:22-31）。这证实了髓鞘重新形成确实能导致功能恢复这一关键点。然而，由于各种疾病或创伤而发生脱髓鞘的大多数患者不发生足够的内源性重新形成髓鞘（Prineas等，Ann.Neurol.1993 33:137-151），并且尽管存在大量需求和努力，但在开发能够帮助恢复丧失的功能的产品方面几乎没有获得进展。这可以部分归因于为了在体内实现受损的产髓磷脂少突神经胶质细胞的再生，必须存在大量信号和复杂的细胞间相互作用。重要的是，在脱髓鞘的动物模型中，引起髓鞘重新形成的细胞疗法已被证明是有益的。

Totoiu等（Exp.Neurol.2004 187:254-265）报道了在病毒诱导的鼠MS模型中鼠GRP的局部移植物在治疗脊髓病变中的益处。GRP迁移并分化成少突神经胶质细胞，引起看起来与轴突保留相关的髓鞘重新形成。他们也观察到运动的改善。后续研究（Hardison等，Exp.Neurol.2006 197:420-429）证实了鼠GRP能够在炎性T细胞和巨噬细胞两者存在下存活并重新形成髓鞘。

由于髓磷脂碱性蛋白编码基因突变而表现出正常髓磷脂产生缺陷的战栗小鼠（shiverer mouce）是用于研究外源性细胞移植物对髓磷脂产生的影响的模型。通过战栗小鼠中的细胞移植，证实了髓磷脂产生与许多脱髓鞘疾病包括TM和MS以及髓鞘形成障碍相关。已显示，人GRP在围产期异种移植后能在战栗小鼠脑中广泛并高效地形成髓鞘（Windrem等，Nat.Med.2004 10:93-97）。证实了分化成区域适合的细胞类型（星形细胞和少突神经胶质细胞），并且没有肿瘤的迹象。对这些研究进行了扩展以显示脑和脊髓两者的髓鞘重新形成，其在部分移植动物中伴有显著的表型援救（Windrem等，Cell Stem Cell 20082:553-565）。

发明内容

本发明的一个方面涉及用于制造哺乳动物神经胶质限制性祖细胞（GRP）的方法。

本发明的另一方面涉及用于减少GRP细胞群中的不想要的细胞表型和/或降低GRP细胞群细胞中的标准偏差的方法。