[发明专利]用于纯化由固相肽合成法制备的肽的化合物和方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于纯化由固相肽合成法制备的肽的化合物和方法。

背景技术

肽的化学合成法被很好的建立。原则上，分为两种不同的方法：溶液中合成，其经常是非常耗时的并因此对科学研究无用；和固相载体上合成，其允许快速优化反应周期。可用于固相肽合成(SPPS)的方案是基于用规定的序列在不溶性固相上合成肽的Merrifield技术(Merrifield，R.B.，J.Amer.Chem.Soc.85，1963，2149)。SPPS的总的原理是基于反复的偶联-脱保护循环：通过羧基端连接在固相上的肽的游离N-端胺与单个N-保护的氨基酸单元偶联。该单元然后脱保护，显露出可以连接另一个氨基酸的新的N-端胺。

然而，现今的SPPS方法除了目标化合物(成熟肽)之外，还产生相对众多的杂质，特别是大量的不成熟肽。因此源自固相肽合成(SPPS)的肽的纯化需要除去由不完全的偶联/脱保护步骤而产生的被删过的肽(即缺乏一个或几个氨基酸残基的肽)，和程度少得多的来自外消旋化或侧链重排的其他肽副产物，以及SPPS程序的脱保护或裂解阶段期间引入的各种化学物质。尤其是，要合成的肽越长，杂质的数量、特别是被删过的肽的数量越多。因此，SPPS法的重要目标是从杂质中高速高收率地只回收目标肽。

因此，已有建议在每次偶联反应后通过乙酸酐进行封端，以终止非目标序列肽链的进一步伸长并避免进一步产生被删过的肽和得到截短的肽。在连接最后的氨基酸后，只有具有完整氨基酸序列的肽在其N-端具有氨基：该氨基可用于纯化目标肽。

已经公开了几篇利用N-端氨基的肽纯化法的报告。然而，这些方法均不能实现有效的一步分离；反而需要复杂的分离过程。

已经开发了另一种方法，其中只有目标肽在它的N-端被两个额外的残基(半胱氨酸-甲硫氨酸)延长，然后与被苯基-汞基团衍生化的固相载体起反应，所述苯基-汞基团利用了选择性结合半胱氨酸的SH基团。在分离之后，甲硫氨酸-肽的酰胺键被BrCN选择性裂解，以产生目标肽(D.E.Kriegeret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，73，3160(1976))。可是，该方法的局限是不适用于含甲硫氨酸或半胱氨酸的肽。

另一种已经公开的方法中，目标肽与固相载体通过SH基团共价连接(美国专利n°5,648,462和n°5,994,588)。可是，该方法的局限是不适用于含半胱氨酸的肽。

因此，需要有其他的方法来纯化通过SPPS产生的肽，所述方法适用于任何类型的肽并且是易于实施的。

发明内容

本发明人发现，在SPPS结束时，并且在肽从固相上脱保护/裂解步骤之前，有可能用包含以连接体分开的两个化学官能团的化合物来选择性标记成熟肽。通过根据本发明所述化合物与特定固相反应，该化合物能因此用于将成熟肽从其他封端的截短肽(不成熟肽)中纯化出来。本发明因此涉及通式(I)的化合物：

X₁-L-X₂(I)

其中：

-X₁选自-N₃或-C≡CH，

-L表示隔开X₁和X₂的连接体，

-X₂选自通式(A)、(B)和(C)的化合物：

其中

■Y₁和Y₂独立地表示-CH-或-N-，

■Y₃表示-OH或离去基团，

■R₁和R₂独立地表示-H、-CH₃或C₂-C₅烷基，

■虚线存在或不存在，

■当虚线存在时，R₃是O且R₄不存在，

■当虚线不存在时，R₃和R₄表示-CH₃；

其中

■R₅表示-H或吸电子基团，

■R₆和R₇独立地表示-CH₃或-H，

■X₃是氨基甲酸酯前体；

和

其中：