[发明专利]改善的细菌膜蛋白分泌

权利要求书

1.一种编码用于引导蛋白质从细菌质膜转运的细菌分泌信号的分离的多核苷酸，所述分泌信号选自pelB的P6S变体(SEQ ID NO：1)和ompA的A11P变体(SEQ ID NO：3)。

2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其与编码外源蛋白的序列有效连接，其中所述外源蛋白待从所述细菌质膜分泌。

3.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中所述外源蛋白还与编码选自pIII、pVII、pVIII和pIX的噬菌体外壳蛋白的序列有效连接，并且其中如此形成的融合蛋白待从细菌质膜分泌。

4.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中所述外源蛋白选自包含肽、抗体重链恒定结构域、抗体重链、哺乳动物受体链、受体胞外结构域、纤连蛋白样结构域和锚蛋白重复结构域的多肽。

5.一种载体，所述载体包含与编码源于外源蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸有效连接的编码细菌分泌信号的核酸序列，所述编码的分泌信号选自pelB的P6S变体(SEQ ID NO：1)和ompA的A11P变体(SEQ ID NO：3)，其中与野生型分泌信号相比，所述分泌信号增强从细菌质膜转运出来的外源蛋白的比例。

6.根据权利要求5所述的载体，其中所述编码的外源蛋白质编码序列还与编码选自pIII、pVII、pVIII和pIX的丝状噬菌体外壳蛋白的序列融合。

7.根据权利要求6所述的载体，所述载体为噬菌粒载体。

8.根据权利要求6所述的载体，所述载体为噬菌体载体。

9.根据权利要求8所述的载体，其中与突变型分泌信号连接的外源蛋白编码序列与pVII融合并且与突变型分泌信号连接的外源蛋白序列与pIX融合，从而导致当所述载体在宿主细胞中复制时所述两种外源蛋白以多拷贝出现在所述噬菌体颗粒的表面上。

10.根据权利要求6所述的载体，其中所述编码的外源蛋白选自肽、抗体重链恒定结构域、抗体重链、哺乳动物受体链、受体胞外结构域、纤连蛋白样结构域和锚蛋白重复结构域。

11.根据权利要求5所述的噬菌体载体，所述噬菌体载体还包含诱导型启动子。

12.根据权利要求11所述的噬菌体载体，其中所述诱导型启动子为lac启动子或lac的突变体。

13.一种丝状噬菌体颗粒，所述噬菌体颗粒包封有根据权利要求3所述的编码与外源蛋白有效连接的分泌信号的多核苷酸，并且在所述噬菌体的表面上具有所述外源蛋白。

14.根据权利要求13所述的丝状噬菌体颗粒，其中所述外源蛋白与丝状噬菌体pVII或pIX蛋白的氨基末端融合，因此当所述蛋白质在丝状噬菌体蛋白质的表面表达时，一个外源蛋白内的半胱氨酸残基与同一丝状噬菌体颗粒的表面上表达的第二外源蛋白上的半胱氨酸残基氧化键合而形成功能性蛋白质结构。

15.根据权利要求14所述的丝状噬菌体颗粒，其中所述功能性蛋白质结构包含抗体Fc区。

16.根据权利要求15所述的丝状噬菌体颗粒，其中所述蛋白质结构的功能活性为FcRn结合。

17.一种细菌宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求13所述的丝状噬菌体。

18.一种根据权利要求17所述的包含丝状噬菌体载体的细菌宿主细胞的噬菌体文库。

19.根据权利要求14所述的噬菌体文库，其中所述每一种多核苷酸编码具有氨基酸置换的形成Fc的序列。

20.根据权利要求15所述的噬菌体文库，其中所述核酸链其中所述形成Fc的序列还包含配体结合结构域。

21.根据权利要求16所述的噬菌体文库，其中所述配体结合结构域选自受体结合配体、受体胞外结构域、包含可变结构域和恒定结构域的抗体Fab结构域以及单链Fv构建体。

22.根据权利要求17所述的噬菌体文库，其中所述Fab结构域包含在所述结合结构域内各特定残基处相互不同的序列。

23.一种使用包含pelB的P6S变体的编码序列的多核苷酸在细菌宿主细胞中表达外源蛋白的方法，其中所述外源蛋白可从支持所述细菌宿主细胞的生长的培养基回收。