[发明专利]改善的细菌膜蛋白分泌

说明书

背景技术

优先权申请

本申请要求于2009年11月17日提交的美国申请No.61/261,768的优先权，将该专利以引用的方式全文并入本文。

技术领域

本发明涉及使蛋白质分泌穿过细菌质膜的改良方法，该方法包括将丝状噬菌体外壳蛋白用于展示外源蛋白质包括可以为单体的、二聚体的或异型二聚体的或多聚体的蛋白质(包括完整抗体或抗体片段，或其他二硫键链接的多聚体构建体)的变体的文库，该方法通过将突变型pelB或突变型ompA分泌信号与所述外源蛋白(exoprotein)构建体连接来实现。

关于本领域的讨论

丝状噬菌体展示是一种广泛使用的基于亲和力选择蛋白质的技术，因为在选择过程中每个噬菌体颗粒将编码多肽的核酸与其外壳蛋白的N端融合连接在一起。M13噬菌体编码五种外壳蛋白，在噬菌体的一端具有大概五个拷贝的次要外壳蛋白pIII和pVI，在噬菌体的另一端具有相同数目的pVII和pIX。噬菌体DNA由大概3000个拷贝的主要外壳蛋白pVIII包封。尽管已经用M13的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示，然而pIII和pVIII仍是目前最常用的融合伙伴。使用该技术，已构建了肽、Fab、scFv和其他蛋白结合物(protein binder)的文库并且可用于各种应用，具有极大商业价值。

由于pIII外壳蛋白的长度和构象其较于其他蛋白质更受欢迎。pIII次要外壳蛋白是负责噬菌体感染进大肠杆菌中的402个氨基酸、42kD的蛋白质，其包括由柔性铰链连接的两个结构域。与pIII N端融合可系住离开噬菌体颗粒的所展示的蛋白质，从而减少了其干扰所需的pIII功能的能力并且进一步使配体能足够接近进行结合。相比之下，pVII和pIX是分别为33个和32个氨基酸的短螺旋蛋白质，在噬菌体表面紧密包装。然而，有报道描述了scFv文库在pIX上的展示(Gao，C.等人，Proc Natl Acad Sci U S A 99，12612-12616，2002)和通过利用使不同多肽与pVII和紧密相邻的pIX二者融合的能力对Fv或Fab文库进行异型二聚体展示(Gao等人，1999 Proc Nat Acad Sci 96：6025-6030和Janda US7078166)。展示pVII融合物的噬菌体也已有报道(Kwasnikowski等人，2005.J Immunol Methods 307：135)。使用杂交噬菌体载体或噬菌粒载体，可在噬菌体上展示与pIX外壳蛋白融合的肽、Fab和其他蛋白质(WO2009/085462、WO2009/085464和WO2009/085468)。也已描述了一种备选的方法，在该方法中由噬菌体或噬菌粒载体编码的外源蛋白(exoprotein)不与外壳蛋白融合，而是通过二硫键键合共价连接至重新工程改造的外壳蛋白pIII和pIX(US6753136)。

大肠杆菌为最广泛用于产生重组蛋白质的宿主之一。然而，在回收正确折叠的蛋白质的大部分产量方面往往存在问题。解决这些问题的一种方法是使重组蛋白质分泌进周质空间或培养基中。分泌制备重组蛋白质具有若干优点，如简化纯化、避免蛋白酶攻击和N端Met延长，以及蛋白质正确折叠的几率更好。

在噬菌体蛋白质的DNA复制和表达后，M13和其他丝状噬菌体在宿主细胞膜处装配。噬菌体结构蛋白转运进膜内中是噬菌体装配的关键步骤。在噬菌体展示的实践中，已将细菌信号肽广泛用于构建体中来帮助融合蛋白转运穿过膜，并且已经是实现某些类型的融合蛋白的展示所关键的。来自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erswinia carotovora)的果胶裂解酶B(pelB)的信号肽已广泛用于增强使用细菌细胞产生蛋白质以及增强在噬菌体展示中产生蛋白质二者。

利用细菌宿主细胞以及以重组文库形式，通过细菌培养或在噬菌体颗粒表面上展示更多样和复杂的蛋白质如二聚体蛋白质的能力在能够进行对经修饰的和重新工程改造的复杂蛋白质结构进行选择方面是有利的。一直需要推进现有技术来产生高度有效的蛋白质制备方法以及筛选复杂蛋白质的变体的高通量方法，所述复杂蛋白质的变体为例如人IgG的变体，人IgG为通过分子间的二硫键连接的重链和轻链对(异型二聚体)的同型二聚体。

发明内容