[发明专利]脐带衬干细胞及其分离和培养方法和材料

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2009年9月23日提交的美国申请流水号61/245,123的优先权。认为在先申请的公开内容是本申请公开内容的一部分(并通过提及而将其收入本申请的公开内容)。

发明领域

本发明涉及来自人的脐带衬干细胞(umbilical cord lining stem cell,ULSC)，且更具体而言，涉及用于分离、培养、扩充、和表征ULSC的方法和材料。

发明概述

本发明基于来自脐带衬里(lining)的细胞群(称作脐带衬干细胞(ULSC))及用于分离此类细胞的方法和材料的发现。ULSC在细胞表面标志物CD73、CD90、CD105、CD106、SSEA-4、和STRO-1方面呈阳性，并且缺乏造血细胞表面标志物CD34、CD45、和HLA-DR。另外，ULSC表达多能性标志物Oct4和Nanog。ULSC可以增殖，实现至少60次群体加倍。ULSC还具有较宽的分化成生脂、生骨、软骨形成、神经源性、和生心细胞的可塑性和能力。上文所描述的结果表明ULSC可以容易地获得，并且在较短的一段时间中在培养中扩充至治疗相关数目。另外，可以冷冻保存ULSC，使细胞适合于细胞保存，供后来治疗使用。

在一方面，本文件的特征在于一种用于自脐带分离ULSC的方法。所述方法包括获得脐带的衬里，其中所述衬里基本上没有血液、静脉组织、和动脉组织；并在存在低葡萄糖生长培养基的情况中将所述衬里的外植体在经纤连蛋白包被的固体基质上培养足以使所述ULSC粘着于所述经纤连蛋白包被的固体基质的时段，所述生长培养基包含15%胎牛血清、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、抗生素(例如，庆大霉素、或青霉素和链霉素)、和选自下组的生长因子：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、和表皮生长因子(EGF)。生长培养基可以进一步包含胰岛素、运铁蛋白、硒、和丙酮酸钠，和(在一些实施方案中)腐胺。在一些实施方案中，生长培养基包含bFGF、LIF、和EGF。每个外植体的上表面可以与固体基质(例如盖玻片)接触。所述方法可以进一步包括清洗粘着于所述经纤连蛋白包被的固体基质的所述细胞。

在另一方面，本文件的特征在于一种用于培养ULSC的组合物。所述组合物包含低葡萄糖生长培养基；10%至20%血清；0.7至1.5%L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽；1至100ng/mL选自下组的生长因子：bFGF、LIF、和EGF；和1至3%抗生素。组合物可以进一步包含0.1mg/mL至100mg/mL胰岛素；0.1mg/mL至100mg/mL运铁蛋白；0.1μg/mL至100μg/mL硒；和0.5至1.5%丙酮酸钠。在一些实施方案中，组合物进一步包含0.05μg/mL至100μg/mL腐胺和1ng/mL至100ng/mL EGF。例如，组合物可以包含15%血清(例如，胎牛血清或人血清)；1%L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽；10ng/mL bFGF；10ng/mL LIF；1%抗生素；10ng/mL胰岛素；0.55mg/mL运铁蛋白；和0.5μg/mL硒，和任选地，10μg/mL腐胺和10ng/mL EGF。

本文件的特征还在于一种包含纯化的ULSC群和培养基的组合物，其中所述培养基包含低葡萄糖生长培养基；10%至20%血清；0.7至1.5%L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽；1至100ng/mL选自下组的生长因子：bFGF、LIF、和EGF；和1至3%抗生素，其中所述ULSC在CD105、CD106、CD90、CD73、SSEA-4、和STRO-1方面呈阳性，而在CD45、CD34、CD19、和HLA-DR方面呈阴性。ULSC表达OCT4和Nanog，而且不表达Sox2。培养基可以进一步包含0.1mg/mL至100mg/mL胰岛素；0.1mg/mL至100mg/mL运铁蛋白；0.1μg/mL至100μg/mL硒；和0.5至1.5%丙酮酸钠，和任选地，0.05μg/mL至100μg/mL腐胺和1ng/mL至100ng/mL EGF。组合物可以进一步包含冷冻保护剂。