[发明专利]用于制备多肽的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种用于在基因修饰的酵母菌株中制备多肽的方法。

发明背景

用适宜的包含编码异源蛋白的DNA序列的表达载体转化酵母细胞后在酵母中表达所述蛋白已经成功地用于多种多肽，例如胰岛素前体、胰高血糖素、胰高血糖素样肽和它们的功能类似物。

然而，经常发现表达产物是各种期望的具有不同的氨基酸链长度的多肽前体的异质混合物。这是因为酵母产生大量负责加工较大的前体分子以释放成熟多肽的蛋白水解酶。包括PEP4和KEX1基因产物在内的大量蛋白酶负责这样的酵母蛋白降解。

使用KEX1破坏株用于重组体蛋白的表达早先已有描述。因此，EP341215和US 6,103,515描述使用缺乏KEX1的酵母菌株用于产生不带碱性C-末端氨基酸的肽，例如hANP、EGF、结缔组织活化肽-III、水蛭素和水蛭素变体。

大半已知的神经肽和内分泌肽是α-酰胺化的，且在大多数情况下，此结构特征对受体识别、信号转导和因此对生物学功能是必不可少的。α-酰胺化源自于C-末端甘氨酸，其被酶促转变为酰胺。

如果细胞具有用于体内α-酰胺化的必要机器(machinery)，那么可直接在生产细胞中生产α-酰胺化肽。然而，包括酵母在内的一些有机体不能产生α-酰胺化，因为它们不表达用于体内α-酰胺化的必要酶，因此通过细胞生产的肽不得不通过随后的体外步骤α-酰胺化。

如果酵母被用作重组体生产细胞，一个解决方案是生产带有C-末端甘氨酸的前体多肽，然后在随后的体外过程中用α-酰胺化酶将其转变为α-酰胺化肽(D. J. Merkler (1994). C-Terminal amidated peptides: Production by the in vitro enzymatic amidation of glycine extended peptides and the importance of the amide to bioactivity (C-末端酰胺化肽：通过甘氨酸延伸肽的体外酶促酰胺化进行生产和酰胺对生物活性的重要性). Enzyme Microb. Technol.: 16(450-456)。

然而，意想不到地，本发明的发明人等已发现C-末端甘氨酸被从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达的大量肽中切除，使得随后转化为α-酰胺化肽不可能。

本发明通过使用不切除C-末端甘氨酸残基的基因修饰的酵母菌株提供一种针对该问题的解决方案。

发明概述

在一个方面，本发明涉及一种在酵母中制备带有C-末端Gly的多肽的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因。

可通过使用熟知的技术使KEX1基因无功能。因此，在一个实施方案中简单地缺失KEX1基因，而在另一个实施方案中通过位点特异突变(例如通过同源重组)使KEX1基因无功能。

在一个实施方案中，本发明涉及一种在具有非功能性KEX1基因的酵母菌株中制备多肽的方法，其中所述多肽具有甘氨酸作为其C-末端氨基酸残基，且其中所述方法包括以下步骤：

a) 将包含编码多肽的DNA序列的酵母菌株在用于在酵母菌株中表达多肽的条件下培养，和

b) 分离表达的多肽。

表达的多肽可从细胞培养物或从酵母细胞中分离，这取决于表达的多肽是否从酵母细胞中分泌。

如果C-末端倒数第二个氨基酸是以下氨基酸残基之一，那么C-末端甘氨酸特别不稳定：Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile和Arg。因此，在一个实施方案中，C-末端倒数第二个氨基酸为Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile或Arg。

“C-末端倒数第二个氨基酸”意指与C-末端氨基酸残基(在该情形中是甘氨酸残基)的N-末端连接的氨基酸残基。

特别地，当C-末端倒数第二个氨基酸是疏水氨基酸残基且特别是芳族氨基酸残基时，C-末端甘氨酸更不稳定。因此，在另一个实施方案中，与C-末端Gly邻接的氨基酸残基是Tyr、Trp、Phe、Val、Leu、Ile或Met，和在另一个实施方案中，与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Val、Leu、Ile或Met，和在另一个实施方案中，与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Tyr、Phe或Trp。