[发明专利]使用大鼠胚胎干细胞构建嵌合大鼠的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备具有提高的种系传递效率的嵌合胚胎的方法，所述方法使用大鼠多能干细胞、特别是大鼠胚胎干细胞（在下文中称作“ES细胞”），使用所述嵌合胚胎制备嵌合大鼠的方法，通过所述方法制备的嵌合大鼠，和可用于制备嵌合大鼠的培养基。

背景技术

ES细胞是一种几乎全能的细胞系，非常适用于制备基因修饰动物等。例如，通过将ES细胞（其中已经破坏了特定基因）注射进要与宿主胚胎的细胞混合的正常宿主胚泡中，并将所述混合物返回子宫，可以生产嵌合动物，通过杂交所得嵌合动物或后代，并选择出生的动物，可以生产其中已经破坏了特定基因的基因修饰动物（敲除动物）。

大鼠是具有比小鼠更适合操作的大小的哺乳动物，且是在不同领域（包括医学）广泛使用的最有用的实验动物之一。因此，一直希望建立大鼠ES细胞并使用所述细胞生产嵌合大鼠。但是，迄今为止尚未建立有效地制备嵌合大鼠的技术，其中ES细胞分化成生殖细胞谱系，来自ES细胞的遗传信息被传递给下一代，而不受大鼠ES细胞的品系和宿主胚胎的品系的影响（即，传递种系的嵌合大鼠）。

关于证实了种系传递的嵌合大鼠的制备，Qi-Long Ying等人的研究组和Austin Smith等人的研究组分别在2008年提供了报道（专利文件1，非专利文件1和2）。在这2个报道中，使用大鼠ES细胞来制备嵌合大鼠；但是，在两种情况下，从ES细胞品系和宿主胚胎品系的多种组合中的仅一种组合成功地制备出传递种系的嵌合大鼠。已暗示在制备敲除大鼠的常规实践中，重要的是使用ES细胞品系和宿主胚胎品系的多种组合来实现嵌合大鼠的制备，这提出了一个在将来要解决的问题。

另外，尽管事实上已经报道了制备传递种系的嵌合大鼠的一些实际案例，尽管如上所述它们是有限的，并没有关于建立基因靶向的基因修饰大鼠（例如，敲除大鼠、敲入大鼠）的报道。这可能是由于起始大鼠ES细胞的特性的影响。

尽管使用MEK抑制剂、GSK3抑制剂和I型TGFβ受体Alk5抑制剂（A-83-01）会建立能够生产嵌合体的大鼠iPS细胞，但尚未实现种系传递（非专利文件3）。另外，还已经报道，MEK抑制剂和Alk5抑制剂的组合会显著提高从人成纤维细胞生产iPS细胞的效率（非专利文件4）。

近年来，Watanabe等人已经发现，Rho结合激酶（Rho相关的激酶; ROCK）抑制剂Y-27632会阻断人ES细胞的细胞凋亡，并在通过酶处理分离出单个细胞以后诱导生长（非专利文件5），也没有报道ROCK抑制剂用于人干细胞培养的有用性（专利文件2）。

[文件列表]

[专利文件]

专利文件1: WO2008/015418

专利文件2: WO2008/035110

[非专利文件]

非专利文件1:Cell, 135, 1299-1310（2008）

非专利文件2:Cell, 135, 1287-1298（2008）

非专利文件3: Cell Stem Cell 4, 16-19（2009）

非专利文件4: Nat. Methods, 6, 805-808（2009）

非专利文件5: Mol. Pharmacol. 57, 976-983（2000）。

发明内容

本发明要解决的问题

本发明的目的是，提供一种制备新颖的嵌合胚胎的方法，所述方法使得可有效地得到传递种系的嵌合大鼠，而无需限制大鼠多能干细胞品系和宿主胚胎品系的组合，使用所述嵌合胚胎制备嵌合大鼠的方法，和它们所用的培养基，并从而提供常规尚不可能制备的、包含大鼠多能干细胞品系和宿主胚胎品系的组合的传递种系的嵌合大鼠。

本发明的另一目的是，提供一种大鼠ES细胞，其即便是在ES细胞制备以后经历基因修饰后，也维持产生嵌合大鼠的能力，特别是将基因修饰传递给种系的能力，以及使用该大鼠ES细胞提供一种基因修饰的、特别是基因靶向的基因修饰大鼠。

解决问题的方法