[发明专利]乳动脉衍生细胞及在组织修复和再生中的应用方法

说明书

相关专利申请

本专利申请为美国临时专利申请No.61/247,228的非临时提交。

技术领域

本发明主要涉及从哺乳动物内乳动脉分离的哺乳动物乳动脉衍生细胞。本发明还涉及分离哺乳动物内乳动脉衍生细胞的方法。将分离的内乳动脉衍生细胞与支架进行组合即提供在组织工程装置中使用的方法。

背景技术

内乳动脉也称内胸动脉，布满于前胸壁和乳腺。内乳动脉与隐静脉移植物相比，具有优异的长期开放性(patency)，被认为是进行冠状动脉旁路移植术的首选主要血管。与冠状动脉和颈动脉相比，乳动脉对动脉粥样硬化有高度耐抗性。与隐静脉相比内乳动脉的这一对移植物动脉粥样硬化的长期耐抗性，已至少部分地被归因于其优异的内皮细胞功能。另外，内乳动脉对机械损伤的响应也与冠状动脉不同。人冠状动脉通过促进细胞迁移和增殖来响应球囊血管成形术，这导致在大约40％的病例中发生新血管内膜形成和再狭窄。但是，与冠状动脉和隐静脉移植物不同，在经皮经腔血管成形术后在内乳动脉移植物中没有发现再狭窄。因此，内乳动脉可能是血管祖细胞的有价值的组织来源。

有大量文献记载，由软骨、骨和脂肪组成的异位组织能够在动脉的壁内形成。这个现象被称为组织转化(metaplasia)，这提示多潜能祖细胞可存在于动脉壁内。动脉壁内的成骨和成软骨分化在临床上被认为是血管钙化，这个类型的矿化与心血管损伤的增加相关。血管钙化已知会增加主动脉硬度，导致收缩期高血压、冠状动脉功能不全、左心室肥大、局部缺血和充血性心力衰竭。事实上，大约85％的造成冠状动脉血栓症的斑块是钙化的。已提出动脉壁内的祖细胞可能在斑块形成、钙化和动脉粥样硬化中起到作用。因此，了解这些细胞如何促成血管病理以及修复，可能有助于改进心血管适应症的疗法。

目前有许多实验室正在努力研究干细胞在血管生理学中的作用。已证实成体器官含有参与器官维护和损伤后修复的干细胞。因此，从许多器官组织类型(如果不是所有器官组织类型的话)分离出成体祖细胞，是可行的。然后便可把这些组织特异性祖细胞开发用于组织特异性治疗的目的。

Zingin等人最近表明在成人血管壁中存在“生血管区”。在这个研究中，从人内胸动脉分离出了推定的祖细胞。为了收获细胞，将动脉切碎并用胰蛋白酶/EDTA在37℃下消化5分钟。过滤除去不消化的组织。将悬浮液离心，所得的细胞沉淀重悬于内皮细胞生长培养基中并接种到包被来的胶原或纤连蛋白的培养皿上。这些细胞显示了CD34的表达。还证实表达KDR/Flk1和CD45的祖细胞存在于内乳动脉的血管壁内。这些资料提示在内乳动脉的壁内存在祖细胞库。

鉴定并分离出可制造且能抵抗动脉粥样硬化的血管壁祖细胞，可能证明是对细胞疗法和组织工程应用有利的。为尝试利用内乳动脉独特的抗粥样硬化性质和机械性质，我们从人内乳动脉分离和表征了独特的祖细胞并评估了它们在组织工程应用中的效用。

发明内容

我们公开了从哺乳动物内乳动脉分离的哺乳动物内乳动脉衍生细胞。还提供了分离哺乳动物内乳动脉衍生细胞的方法。对哺乳动物内乳动脉衍生细胞进行了以下方面的表征：细胞形态、生长潜力、表面标志物表型、分泌蛋白、基因表达、多潜能分化和体内促血管生成活性。这些细胞对于细胞和组织的工程应用都具有效用。

附图说明

图1：形态学。将iMAC(内乳动脉衍生细胞)在包被胶原的组织培养瓶上进行培养，在第2次传代(A)、第7次传代(B)和第23次传代(C)获取相位对比图像。细胞显示均匀的成纤维细胞形态。

图2：生长动力学。将iMAC在包被胶原的瓶上培养81天。收获细胞，每隔3-5天进行计数，确定群体倍增。培养物能够达到至少41.9次群体倍增。

图3：毛细血管形成。将iMAC和人内乳动脉内皮细胞(EC)分别在包被Matrigel的板上进行培养，观察毛细血管形成。将细胞在三种不同类型的培养基中进行培养，包括iMAC生长培养基、内皮细胞生长培养基-2(EGM-2)或平滑肌细胞分化培养基(SMC培养基)。在生长于iMAC生长培养基或EGM-2中的iMAC培养物中观察到密集的毛细血管形成。图像是在100x放大倍数下获取的。

图4：脂肪生成。将iMAC在脂肪生成诱导培养基中培养15天。在诱导后5天、10天和15天，将培养物固定并用Oil Red-O染色。细胞内的脂质小滴染成红色。左下小图中显示的第5天培养物的图像是在400x放大倍数下获取的。所有其他图像是在200x放大倍数下获取的。