[发明专利]对辛伐他汀合成表现出改善性质的LovD突变体

说明书

政府资助的声明

本发明是在政府支持下由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号HL091197资助完成。政府享有本发明的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请根据119(e)条款要求2009年10月8日提交的美国临时申请序列第61/249,894号的优先权，其内容通过引用纳入本文。本申请涉及国际申请号PCT/US2007/012362（国际公开号WO 2007/139871)，其内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及用于生物合成化合物如辛伐他汀的方法和材料，包括利用微生物宿主的过程。

发明背景

辛伐他汀是可分离自土曲霉(Aspergillus terreus)发酵液的天然产物洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀和辛伐他汀都是降胆固醇药，能显著降低成人的心脏病风险。洛伐他汀和辛伐他汀由默克公司(Merck Co.)分别作为美降之(Mevacor)和舒降之(Zocor)销售。辛伐他汀是洛伐他汀的更强效衍生物，并在2005年是美国第二畅销药物，单在美国就有45亿美元的预期销售。

土曲霉(A.terreus)中用于洛伐他汀生物合成的基因簇(参见例如，J.Kennedy,K.等，Science,1999,284,1368-1372；和C.R.Hutchinson,J.等，Antonie Van Leeuwenhoek 2000,78,287-295)此前已有描述(参见例如，美国专利号6,391,583，其内容通过引用纳入本文)。在所述基因簇中编码的是46kD的蛋白质LovD，该蛋白最初鉴定为酯酶同系物。洛伐他汀生物合成的直接前体红麴素J(Monacolin J)由上游巨合酶(megasynthase)LovB组装(参见例如，L.Hendrickson,C.R.等，Chem.Biol.1999,6,429-439)，(该酶也称为洛伐他汀九酮合成酶，LNKS)，烯酰基还原酶LovC和CYP450氧化酶。五碳单元侧链由LovF(洛伐他汀二酮合成酶，LDKS)通过乙酰-CoA和丙二酰-CoA之间的缩合合成。缩合的二酮由单独LovF结构域进行甲基化和还原性修饰产生共价连接于LovF酰基载体蛋白(ACP)结构域的磷酸泛酰巯基乙胺臂上的α-S-甲基丁酰基硫酯(参见例如，J.Kennedy,K.等，Science,1999,284,1368-1372和C.R.Hutchinson,J.等，Antonie Van Leeuwenhoek2000,78,287-295)，随后从红麴素J生成洛伐他汀。在土曲霉中灭活LovD或LovF导致前体红麴素J的积累(参见例如，J.Kennedy,K.等，Science,1999,284,1368-1372和C.R.Hutchinson,J.等，Antonie Van Leeuwenhoek 2000,78,287-295)。

一旦制得洛伐他汀，例如在土曲霉宿主中经发酵制得，可从洛伐他汀生成辛伐他汀。目前，辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀经土曲霉宿主的发酵获得。纯化该化合物后，如下进行半合成：1)2-甲基丁酯侧臂可在碱的存在下水解产生中间体红麴素J；2)将游离酸内酯化；3)将C13处的醇官能团用保护基团(例如，叔丁基二甲基硅烷基)保护；4)将显露的C8醇用酰基底物如2-二甲基丁酰氯酯化产生C13保护形式的辛伐他汀；以及5)将C13 OH去保护产生辛伐他汀。