[发明专利]多功能等位基因

权利要求书

1.一种核酸构建体，其包含：

（a）用于将所述核酸构建体导向细胞的核酸的靶基因的靶向臂；

（b）就所述靶基因的转录而言以有义方向的起动序列，和以有义或反义方向的药物选择盒（DSC）；

（b）以反义方向的目的核苷酸序列（NSI）和COIN；和，

（c）在暴露于第一种重组酶后重组以形成条件等位基因的可重组单位，其

（i）缺乏所述起动序列和所述DSC，且

（ii）含有以有义方向的所述NSI和以反义方向的所述COIN；

其中所述可重组单位包含由所述第一种重组酶识别的2个第一对同源重组酶识别位点，由第二种重组酶识别的2个第二对同源重组酶识别位点，和由第三种重组酶识别的1个第三对同源重组酶识别位点；其中所述第一对、第二对和第三对重组酶识别位点由不同重组酶识别。

2.权利要求1的核酸构建体，其中当进一步暴露于第二种位点特异性重组酶时，所述条件等位基因重组，以形成缺乏NSI且具有以有义方向的COIN的等位基因。

3.一种用于修饰非人细胞的方法，其包括：

用权利要求1的核酸构建体靶向细胞中的目的核苷酸序列，以形成被靶向的细胞，使所述被靶向的细胞暴露于所述第一种重组酶，以形成所述条件等位基因，并且使所述条件等位基因暴露于第二种重组酶，其切除所述NSI且将所述COIN置于有义方向。

4.权利要求3的方法，其中所述细胞中的NSI是与表型相关的外显子或核苷酸序列。

5.权利要求4的方法，其中所述细胞中的目的核苷酸序列由权利要求1的所述核酸构建体替换。

6.权利要求5的方法，其中所述表型在形成所述被靶向的细胞后但在暴露于所述第一种重组酶前第一次测定。

7.权利要求6的方法，其中所述表型在暴露于所述第一种重组酶后第二次测定。

8.一种核酸构建体，其包含：

药物选择盒（DSC），报道分子，COIN，目的核苷酸序列（NSI），和在所述报道分子、所述DSC、所述COIN和所述NSI中排列的5对重组酶位点；

其中没有重组酶位点与任何其他对相同，并且其中第一个2对重组酶位点由相同的第一种重组酶识别，第二个2对重组酶位点由相同的第二种重组酶识别，并且第五对重组酶位点由第三种重组酶识别；

其中所述第一种、第二种和第三种重组酶并不相同，并且其中就转录方向而言，所述报道分子处于有义方向，所述NSI处于反义方向，所述COIN处于反义方向，并且所述DSC处于有义或反义方向；和，

其中所述第一个2对和第二个2对重组酶位点这样排列，从而使得在暴露于所述第一种重组酶后，形成经修饰的等位基因，其中所述第一个2对重组酶位点指导所述报道分子的切除、所述DSC的切除、所述NSI至有义方向的倒转，以及所述COIN维持反义方向，并且（a）所述第二个2对重组酶位点这样排列，从而使得在暴露于所述第二种重组酶后，所述NSI被切除，并且所述COIN置于有义方向；或（b）所述第二个2对重组酶位点这样排列，从而使得在暴露于所述第二种重组酶后，所述NSI置于反义方向，并且所述COIN置于有义方向。

9.根据权利要求8的核酸构建体，其中所述第五对重组酶位点这样排列，从而使得在暴露于所述第三种重组酶后和在不存在暴露于所述第一种或第二种重组酶的情况下，所述第五种重组酶切除那个COIN、所述NSI和所述DSC，且维持所述以有义方向的报道分子。

10.根据权利要求8的核酸构建体，其中所述核酸构建体插入基因内，并且就所述基因的转录方向而言，从5'到3'，所述构建体包含以有义方向的报道分子、以有义或反义方向的DSC、以反义方向的NSI和以反义方向的COIN。

11.根据权利要求10的核酸构建体，其中所述DSC处于有义方向。

12.根据权利要求8的核酸构建体，其中所述核酸构建体插入基因内，并且就所述基因的转录方向而言，从5'到3'，所述构建体包含以反义方向的COIN、以反义方向的NSI、以有义或反义方向的DSC和以有义方向的报道分子。

13.根据权利要求12的核酸构建体，其中所述DSC处于有义方向。