[发明专利]多功能等位基因

说明书

发明领域

本发明涉及用于修饰基因组的核酸构建体，包括敲除构建体和用于将COIN置于基因组中的构建体。包括经遗传修饰的非人动物，例如具有以所选重组酶识别位点排列的基因或核酸元件的经遗传修饰的小鼠，所述重组酶识别位点允许基因或核酸元件的缺失或倒转，以在非人动物例如小鼠和大鼠中形成无效（null）等位基因、可选择的等位基因、报道等位基因和/或条件等位基因。

背景

一般地，通过用选择的另一种序列通常为报道分子和选择盒同源替换靶基因进行敲除，其中所述另一种序列优选邻侧为位点特异性重组酶位点，以准许经由同源位点特异性重组酶的作用去除选择盒。随后可以通过用相应同源重组酶处理细胞或通过使小鼠后代与“缺失者（deletor）”品系繁殖去除选择盒。例如，在floxed等位基因的情况下（其中目的序列邻侧为loxP位点），同源重组酶是Cre，并且在基因组中剩余的是单个loxP位点和报道分子。

相关策略已照常规用于生成条件-无效等位基因。这涉及以这样的方式使目的基因与位点特异性重组酶识别位点（例如用于Cre的lox，和用于Flp的FRT）部分侧接，从而使得在同源重组酶作用后，邻侧为位点特异性重组酶识别位点的区域被缺失，并且所得等位基因是无效等位基因。

尽管已做出将无效和条件功能性两者都并入一种靶向载体中且在单个靶向步骤中实现构建相应经修饰的等位基因的尝试，但由此类尝试产生的方法具有几个缺点且不是完全成功的。这些缺点包括例如真正功能性的缺乏（即无效形式不是真实无效的，条件等位基因不是真正条件的，缺乏报道分子功能等）或不能实现具有所需特征的实际工作等位基因。

因此，本领域需要当经改造的基因座是多功能基因座时，经由靶向生成经遗传修饰的生物体，例如真正的KO-first等位基因和随后条件-无效或其他条件-突变体等位基因。

附图简述

图1举例说明重组酶识别位点的使用，以同时缺失一个元件（U）并倒转另一个（D）。

图2举例说明用于目的核苷酸序列（NSI）显示的，多功能等位基因（MFA）等位基因的一个实施方案，采用具有剪接区的剪接受体和起动序列随后为多聚腺苷酸化（pA）信号、药物选择盒（DSC；以选择的合适方向）、COIN和5对重组酶识别位点。R1/R1’、R2/R2’、R3/R3’、R4/R4’和R5/R5’代表重组酶识别位点的同源对。

图3举例说明实施MFA等位基因的一个实施方案的可重组单位（由R1/R1’、R2/R2’、R3/R3’、R4/R4’和R5/R5’定义）的概念图，所述MFA等位基因采用起动序列（为简单起见，未显示在序列前的剪接受体和剪接区、以及在序列后的polyA信号）、DSC（以选择的合适方向）、NSI和COIN。

图4举例说明具有特异性重组酶识别位点的MFA的特定实施方案用于举例说明目的（上），且生成包括包含LacZ序列的起动序列的“净化”无效等位基因，且使用单个重组酶步骤去除来自最初MFA实施方案的DSC以及NSI和COIN元件。为简单起见，未显示在LacZ序列前的剪接受体和剪接区以及在LacZ序列后的多聚腺苷酸信号。

图5举例说明生成条件等位基因的MFA的特定实施方案，所述条件等位基因使用单一重组酶（此处，Flp重组酶首先作用于等位基因实施方案的FRT3位点）含有/并入来自MFA的COIN。为简单起见，未显示在LacZ序列前的剪接受体和剪接区以及在LacZ序列后的多聚腺苷酸信号。

图6举例说明生成条件无效等位基因的MFA的实施方案，所述条件等位基因使用单一重组酶（此处，Flp重组酶首先作用于等位基因实施方案的FRT位点）含有/并入来自MFA的COIN。为简单起见，未显示在LacZ序列前的剪接受体和剪接区以及在LacZ序列后的多聚腺苷酸信号。

图7举例说明这样的实施方案，其中在重组酶处理后（如图5或图6中所示的Flp暴露），使等位基因暴露于第二种重组酶（Cre），导致NSI的缺失和COIN以用于转录的有义方向的放置。

图8举例说明这样的实施方案，其中在重组酶处理后（Flp暴露），使等位基因暴露于第二种重组酶，导致COIN和NSI的倒转，由于在NSI的5'位置关于第二种重组酶的重组酶识别位点的放置（备选）。