[发明专利]生产头孢拉定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于在厌氧条件下制备头孢拉定的酶方法。

发明背景

在生产头孢拉定的化学方法中，二氯甲烷用作溶剂时，7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)中的氨基用二氢苯基甘氨酸(DHPG)侧链酰化。例如，在二氯甲烷中的D(-)-α-2，5-二氢苯基甘氨酸甲基邓钠盐和新戊酰氯可被添加至7-ADCA和1，8-二氮杂双环-(5，4，0)-十一碳-7-烯(DBU)在二氯甲烷中的溶液中。所得的反应混合物包含具有保护基团的头孢拉定。受保护的中间产物(诸如具有保护基团的头孢拉定)的用途就生产头孢菌素(例如头孢拉定)的化学方法而言是特有的。为去除保护基团，水和HCl被添加至反应混合物。反应混合物和添加的酸性溶液形成两相体系，其随后被分为两个单独的相：有机相，其包含大部分二氯甲烷和新戊酸，带有一些残留水；和水相，其包含溶液中的水、头孢拉定和HCl，以及残留二氯甲烷。典型地，通过生产头孢拉定的所述化学方法和随后对反应混合物的分离获得的酸性水溶液的pH低于3.2。随后，通过pH改变从水相中回收形成的头孢拉定；可添加络合剂。可添加例如DMF或喹啉以产生固体头孢拉定络合物，其随后被转化为头孢拉定。

一般性的半合成抗生素并且特别是头孢拉定的化学合成的大的缺点是，使用有机溶剂诸如二氯甲烷和DMF进行这些化学方法。这使得这些方法环境不友好，因为产生了大量的化学/溶剂废物。

酶的引入带来了半合成抗生素合成中的重大突破，所述酶能在水性环境中将侧链(例如PG、HPG、DHPG，都以酰胺或酯的活化形式)与核心(例如7-ADCA或6-APA)偶联，因而避免消耗有机溶剂。

WO97/04086公开了通过将母体β-内酰胺与活化形式的侧链反应酶促生产β-内酰胺类抗生素，包括通过7-ADCA与活化形式的DHPG(DHPGa)反应制备头孢拉定。该公开文本除描述了合成反应，即活性侧链与母体β-内酰胺的反应之外，还描述了通过目标产物和活性侧链的水解会形成侧链酸。在头孢拉定的酶生产的情况下形成的侧链酸是D-二氢苯基甘氨酸(DHPG)。WO 97/04086此外还公开了在存在野生型E.coli酰化酶的情况下对头孢拉定进行的酶合成，其示出，当青霉素酰化酶被固定到特定的载体上时，会获得增加的合成/水解(S/H)比。在WO 97/04086的方法中，已实现了高达68％的从7-ADCA和二氢苯基甘氨酸甲酯到头孢拉定的转化率。在WO2005/003367中，WO97/04086的酶方法被进一步改进，导致至少70％的7-ADCA到头孢拉定的转化率同时保持D-二氢苯基甘氨酸(DHPG)在反应混合物中的浓度低于2wt.％。

药典指出，当头孢拉定被用作活性药物成分(API)时，其不应含有超过5.0％的头孢氨苄。头孢氨苄的分子结构与头孢拉定的分子结构非常相似，仅有的差异是侧链：头孢拉定的情况下为DHPG和头孢氨苄的情况下为PG。

头孢拉定是不稳定的并在氧的影响下被转化为头孢氨苄。由于该原因，头孢拉定在其工业生产之后，通常在氧被减到最少的条件下存储和操作。例如，合适的包装是在密封袋中在真空下进行。通常，生产方法之后获得的头孢拉定应含有少于由药典指出的5.0％的头孢氨苄，以在头孢拉定的直到其最后有效期的存储期间，允许形成一些头孢氨苄。

头孢氨苄在头孢拉定中存在的另一个原因是在合成中使用的DHPG已被一些PG污染。对于工业级的DHPG，PG的量可高至2％并通常在1％左右。DHPG还不稳定并应小心存储和操作以防止氧化为PG。头孢拉定的化学合成导致具有约1.0-1.5％头孢氨苄的产物。

本发明人现已发现，在由7-ADCA和活化形式的DHPG酶合成头孢拉定的条件下以及还在DHPG的活化期间，实际上可发生更多的氧化，这导致较之化学合成路线的含有过高水平的头孢氨苄的头孢拉定。得到了高于药典规定的那些水平的水平，例如在5-10％之间。因而本发明的目的是提供在所获得的头孢拉定在存储之后还仍符合药典的规定的条件下由7-ADCA和DHPG酶合成头孢拉定的方法。

发明详述

缩写词表

6-APA：6-氨基青霉烷酸

7-ADCA：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸

DHPG：D-二氢苯基甘氨酸

DHPGa：活化形式的D-二氢苯基甘氨酸

DHPGM：D-二氢苯基甘氨酸甲酯

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

DCME：二氯甲烷

HPG：D-羟苯基甘氨酸