[发明专利]检测微生物的方法和其套件

说明书

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2009年12月22日的美国临时专利申请No.61/288,883的权益，该专利的公开内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及利用荧光底物化合物检测微生物的方法。

背景技术

7-羟基香豆素-基染料（也称为伞形酮）和其衍生物广泛用作酶活性的指示剂。伞形酮的一个例子为4-甲基伞形酮（称为4-MU），其用于检测大肠杆菌等等。从碱性形式观察到4-MU（和其他伞形酮）的最高荧光，因此这种检测必须在pH 8到10下进行。

发明内容

存在许多需要在较低pH值下检测响应的情况。例如，酸性磷酸酶的动力学研究需要实时检测酸性培养基中的酶活性。在酸性pH下观察荧光的能力还将消除方案中的必要步骤，从而使得分析更快更容易。因为期望进行低pH荧光分析，所以仍然需要可不顾pH而进行的分析方法。

本文所公开的是一种检测试验样本中的微生物的方法，该方法包括以下步骤：a)用酶底物培育试验样本以形成培育样本，其中该酶底物包括酶可水解基团和荧光基团，其中试验样本中存在的微生物包括从荧光基团上水解可水解基团以形成荧光可检测产物的酶，其中所述荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式；b)用波长Exλiso的光激发该荧光可检测产物历时足以使荧光可检测产物发射光的时间，其中Exλiso为荧光可检测产物的吸光度等吸光点；和c)检测在波长Emλ1处发射的光。

本发明还公开了一种检测试验样本中的微生物的方法，该方法包括以下步骤：a)用酶底物培育试验样本，其中所述酶底物包括酶可水解基团和荧光基团，其中试验样本中存在的微生物包括从所述荧光基团上水解所述可水解基团以形成荧光可检测产物的酶，其中所述荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式；b)用波长为Exλiso的光激发所述荧光可检测产物历时足以使所述荧光可检测产物发射光的时间，其中Exλiso为所述荧光可检测产物的等吸光点；c)检测由于用波长Exλiso的光激发而在波长Emλ1处发射的光；d)用波长为Exλ2的光激发所述荧光可检测产物历时所述荧光可检测产物足以发射光的时间，其中Exλ2为所述荧光可检测产物的碱性形式的吸收最大值或所述荧光可检测产物的酸性形式的吸收最大值；e)检测由于用波长Exλ2的光激发而在波长Emλ1处发射的光；和f)计算基于由于Exλiso激发光而发射的光与由于Exλ2激发光而发射的光的比率，其中所述比率表征所述试验样本中存在的微生物的量。

本发明还公开了一种用于测试试验样本中微生物的存在的套件，所述套件包括：包括酶可水解基团和荧光基团的酶底物，其中所述试验样本中存在的微生物包括从所述荧光基团上水解所述可水解基团以形成荧光可检测产物的酶，其中所述荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式；和能够提供波长为Exλiso的光的光源，其中Exλiso为所述荧光可检测产物的等吸光点，并且其中用波长Exλiso的光激发所述荧光可检测产物导致所述荧光可检测产物发射光。

附图说明

参照以下结合附图对本发明的多个实施例的详细说明，可更全面地理解本发明，其中：

附图未必按比例绘制。在附图中使用的相同的标号表示相同的部件。然而，应当理解，在给定附图中使用标号指示部件并非意图限制另一个附图中用相同标号标记的部件。

图1A、图1B和图1C为针对不同pH值的4-甲基伞形酮(4-MU)的吸收光谱（图1A），针对两个不同激发波长的随pH变化的发射（激发455nm）（图1B），和针对不同pH值的400nm至500的发射光谱（图1C）；

图2为描述本文所公开的示例性方法的流程图；

图3为描述本文所公开的示例性方法的流程图；

图4为描述本文所公开的示例性方法的流程图；

图5A、图5B和图5C为随pH变化的发射光谱(375nm)（图5A），在三个不同激发波长下随pH变化的发射光谱(455nm)（图5B），和在不同波长下激发的峰发射的比率的图线（图5C）；

图6为随pH变化的7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯(EHC)的发射(450nm)光谱；

图7A、图7B和图7C为针对不同pH值的3-(2-噻吩基)伞形酮(TU)的吸收光谱（图7A），随pH变化的在380nm处激发后的发射（图7B），和随pH变化的在405nm处激发后的发射（在500nm处）和随pH变化的在380nm处激发后的发射（在490nm处）（图7C）；