[发明专利]缺氧调节的条件沉默性AAV表达血管生成诱导因子

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年10月39日提交的美国临时申请第61/256,381号的优先权，其通过引用全文纳入本文。

发明领域

本发明的实施方式包括治疗组织缺氧和相关情况。具体地，通过表达所需因子的条件沉默载体表达在患者中诱导定向治疗性血管生成。

背景技术

治疗血管生成是开发用于治疗缺血的方法，其中在缺血组织中响应由基因或者细胞递送的外源血管生成因子而诱导新血管生长。主要的临床目标是由冠状和外周动脉疾病分别造成的心肌和重症下肢缺血。基因和前体干细胞的有说服力的临床结果产生一系列的II/III期临床试验。这些只是适度成功，显示了程序的安全性，但疗效最小。

发明内容

此总结提供本发明的概要以简要说明发明的性质和物质。应当理解的是，它不会用于解释或限制所附权利要求的范围或意义。

优选实施方式包括促进选择性定向动脉发生的载体，其在一些实施方式中由缺氧调节的条件沉默性AAV载体来专门驱动。这些组合物由强烈组织缺氧调控的NRSE和TOAD/FROG沉默元件组合的生长因子表达来提供更快、更高效血管重生和组织恢复。提供了方法，其中，生长因子基因表达的条件沉默提供以条件沉默程度决定的定向动脉发生。这产生缺血组织的高效血管重生，其也由条件沉默的程度来决定。

在其他优选实施方式中，包含FROG/TOAD和NRSE沉默子的载体赋予组织缺氧的强烈调控和由三个沉默元件(NRSE/FROG/TOAD)组合影响的最大反应的更迅速血管重生。这三个异源沉默元件的意外属性可能归因于相较单独NRSE相的多种不同细胞基因表达的沉默，其中沉默限于非神经细胞，并且在干细胞中功能弱或者没有。

在其他优选实施方式中，使用基因调控元件组合在包含永久递送基因治疗载体的骨骼肌和心肌缺血组织中选择性表达促血管生成基因，从而基因的调控表达促进引起肌肉再灌注的稳定成熟血管的生长。

在另一优选实施方式中，调控系统递送基因到靶细胞，包括骨骼和心脏肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、干细胞等。

其他方面在下文描述。

附图简要说明

图1A-1E：组织缺氧调控的转基因表达。图1A的示意图显示基因表达的条件沉默由NRSE组蛋白去乙酰化酶活性和HIF-1组蛋白乙酰化酶活性间的相互作用操作。图1B-1D显示条件沉默的基因调控。图1B-1C：心肌细胞，HeLa细胞或者C2-C12骨骼肌细胞用所示AAV穿梭载体和内部对照Renilla荧光素酶共同转染。转染后24小时，培养物在有氧或缺氧(0.5％-1％氧气)空气下再孵育24小时，并收集以检测荧光素酶表达。图1D：C2C12肌细胞用PGK或CS-PGK引导的AAV-GFP转染，并如所示暴露于空气或缺氧情况下。图1E：C2C12肌细胞用PGK或CS-PGK引导的AAV-VEGF转染，并暴露于空气或缺氧情况下，分泌的VEGF通过ELISA在24小时的培养基中检测。

图2A的示意图显示如图2C所示的FROG，TOAD，和FROG+TOAD元件的序列。IRE是炎症反应元件(NFκ-B)。构建体的其他成分与图1A-1E中描述的NRSE构建体相同。图2B：C2C12细胞用由包含FROG/TOAD元件+HRE的PGK启动子引导的荧光素酶表达质粒转染。如图1A-1E所述，细胞暴露于有氧或缺氧情况下孵育48小时。

图3A-3C显示CS-AAV对比腺病毒的后肢缺血再灌注。图3A：在小鼠后肢中诱导局部缺血并且在手术后由肌肉注射递送指定载体。对所述每组12只小鼠肢体进行多至12周的每周多普勒(Doppler)扫描，然后每月扫描。每个时间点杀死小鼠，肌肉用RT-PCR来定量hVEGF或固定和石蜡包埋以用于免疫染色。正方形(上部曲线)AAV-CS-VEGF：圆和三角形(下部曲线)腺病毒(Ad)低和高剂量。Ad-VEGF自动切除的所有肢体；黄色箭头指示6月康复的AAV肢体的流。图3B：在指定次数(n＝3)肢体肌肉中用RT-PCR定量VEGF表达。图3C：对比AAV-CS-VEGF(绿色)，AAV-PGK-VEGF(红色)和PBS(低曲线)的后肢再灌注。方法如图3A所示；两个AAV载体都恢复流，但是流在CS-VEGF上恢复更快。

图4显示使用平滑肌肌动蛋白抗体对石蜡包埋组织部分的免疫染色，揭示12周后，AAV9-CS-VEGF处理相较AAV9-PGK-VEGF载体在后肢有显著更大的血管(AAV9-PGK-VEGF通过组织缺氧经内源HRE调控，但是没有条件沉默，调控降低)。