[发明专利]使用未经加工的血液的PCR和HLA分型的方法

权利要求书

1.一种用于扩增兴趣DNA的方法，包括：

获得包括DNA的未经加工的样本；

在未经加工的样本上进行第一PCR来产生第一扩增子；

稀释第一扩增子；以及

就此进行第二PCR直到第二PCR反应中所用的所有引物被耗尽，来产生第二扩增子，从而将输入样本DNA扩增到最终扩增的DNA产物浓度，这受到第二PCR反应中引物浓度的限制，所述第二PCR反应不依赖于包括原始样本的DNA的量或纯度。

2.根据权利要求1的所述方法，包括：

在未经加工的样本上平行进行一组基因靶的第一PCR来产生第一组扩增子；

稀释第一组扩增子；以及

使用一级扩增子产物的整组作为第二PCR反应的一组模板，就此进行第二PCR，直至所有二级PCR引物被耗尽来产生第二扩增子组，从而扩增DNA。

3.根据权利要求2的所述方法，其中可平行扩增5个以内基因靶、10个以内基因靶或20个以内基因靶。

4.根据权利要求2的所述方法，其中基因靶是HLA-DRB1、DQ-A1和DQ-B1，是DQ-A1和DQ-B1或者是HLA-B和KIR。

5.根据权利要求2的所述方法，其中基因靶是线粒体复制起点附近的两个高变区以及一个或多个额外的线粒体基因。

6.根据权利要求2的所述方法，其中基因靶是微生物特异性微生物16S DNA基因的区段，所述方法在未经加工的样本中检测微生物。

7.根据权利要求1的所述方法，还包括用一个或多个荧光团标记第二PCR引物。

8.根据权利要求7的所述方法，其中荧光团是菁染料。

9.根据权利要求8的所述方法，其中DNA包括一个或多个兴趣基因，还包括：

第二扩增子与具有兴趣基因相关等位基因变异的序列的探针进行杂交；

从杂交的扩增子检测荧光图式；以及

基于荧光图式指定等位基因型。

10.根据权利要求9的所述方法，其中兴趣基因是HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-DRB1基因、HLA-DQA1基因、或HLA-DQB1基因。

11.根据权利要求1的所述方法，其中第一PCR的引物是基因座特异性引物。

12.根据权利要求11的所述方法，其中引物具有SEQ ID NOS：1-14所显示的序列。

13.根据权利要求1的所述方法，其中靶向DNA序列的第二PCR反应的引物包含在第一PCR反应的扩增产物中。

14.根据权利要求13的所述方法，其中第二PCR反应的引物是一组多外显子特异性引物。

15.根据权利要求14的所述方法，其中引物具有SEQ ID NOS：15-27所显示的序列。

16.根据权利要求1的所述方法，还包括：

对第二扩增子进行测序用于其分析。

17.根据权利要求16的所述方法，其中分析确定身份、个体亲权、法医信息、组织配型、疾病发展的风险因素、或对药物的反应中的一个或多个。

18.根据权利要求1的所述方法，其中未经加工的样本是新鲜的或重新水化的，并包括未处理的流体血液、干燥的未处理的血液、新鲜的颊拭子样本、干燥的颊拭子样本、排泄物材料、阴道样本或通过擦拭有生命的或无生命的表面或物体获得的样本。

19.根据权利要求1的所述方法，其中DNA是线粒体DNA。

20.一种用于扩增一个或多个兴趣RNA的方法，包括：

从个体获得未经加工的生物样本；

在未经加工的生物样本上进行第一逆转录PCR来产生第一cDNA扩增子；

稀释第一扩增子并就此进行第二PCR直至所有引物被耗尽来产生第二扩增子，从而扩增兴趣RNA。

21.根据权利要求20的所述方法，还包括用一个或多个荧光团标记第二PCR引物。

22.根据权利要求21的所述方法，其中荧光团是菁染料。