[发明专利]使用未经加工的血液的PCR和HLA分型的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本国际申请依据35U.S.C.120要求2010年9月24日提交的待决非临时申请U.S.序列号12/924,301的优先权，其依据§119（e）要求2009年11月16日提交的临时申请U.S.序列号61/281,404的优先权，两者整体纳入此处作为参考。

技术领域

本发明涉及PCR和HLA分型的领域。更具体地，本发明公开了用来在露天场地或医务室环境内以个体或群体规模，扩增未经加工的生物标本中的DNA或RNA及其随后的HLA分型的串联PCR过程的方法和系统。

背景技术

在当前医疗中，对HLA分型的医学意义有着新且迅速增长的认识。作为一个实例，表1证明了HLA分型广阔范围的诊断和公共健康应用。

表1

然而，目前，HLA分型实际地需要整个分子遗传学实验室的努力。收到的血液标本必须首先通过方法（比如离心柱（spin column）或磁珠）进行纯化，随后是通过方法（比如PicoGreen荧光法或UV吸收）对纯化的DNA进行定量。定量的DNA然后进行PCR扩增，PCR之后，然后通过高通量再测序或最近的通过珠或通过微阵列的多路杂交分析进行分析。因此，由此产生的工作流需要整个分子遗传学实验室的努力，并且需要至少一整天来编译最终的HLA分型数据。这样的标准工作流的复杂性还带来了有关保管链（chain-of-custody）的很大关注以及对复杂且昂贵的LIMS系统和工作流的标准操作程序的需要，来跟踪流经若干加工和分析工作站的样本。

简化过程的努力已包括免去DNA纯化。即使可获得用于标准PCR的Taq聚合酶的变体时，从未纯化的血液中进行PCR扩增的之前的尝试仍存在问题。使用未经加工的血液作为PCR底物尚未取得一致结果，原因是样本与样本间极端的血液白细胞补体的差异以及样本与样本间可能的极过量的血液溶质中的差异，这种差异可干扰潜在的PCR反应。

因此，本领域认识到对基因扩增和HLA分型方法的低设备和消费成本、高通量的需要。具体来说，本发明在解放双手的或自动的、实时高分辨率的HLA分型方法方面有缺陷，而不需要首先在外部从样本中纯化DNA。本发明实现了本领域中这一长期的需要和希望。

发明内容

本发明针对用于扩增兴趣DNA的方法。该方法包括获得包括DNA的未经加工的样本，在未经加工的样本上进行第一PCR来产生第一扩增子并稀释第一扩增子。就此进行第二PCR直到第二PCR反应中所用的所有引物被耗尽，来产生第二扩增子，从而将输入样本DNA扩增到最终扩增的DNA产物浓度，这受到第二PCR反应中引物浓度的限制，所述第二PCR反应不依赖于包括原始样本的DNA的量或纯度。

本发明针对相关的发明，其中在未经加工的样本上在一组（set）基因靶上平行进行第一PCR来产生第一组扩增子，并稀释第一组扩增子。使用一级扩增子产物的整组作为第二PCR反应的一组模板，就此进行第二PCR直至所有二级PCR引物被耗尽来产生第二扩增子组，从而扩增DNA。

本发明针对另一个相关的方法，其还包括用一个或多个荧光团标记第二PCR引物对。

本发明针对另一个相关的方法，其中DNA包括一个或多个兴趣基因并且方法还包括第二扩增子与具有兴趣基因相关的等位基因变异的序列的探针杂交，从杂交的扩增子检测荧光图式并基于荧光图式指定等位基因型。

本发明针对另一个相关的方法，其还包括对第二扩增子进行测序用于其分析。

本发明还针对用于扩增一个或多个兴趣RNA的方法。方法包括从个体中获得未经加工的生物样本，在未经加工的生物样本上进行第一逆转录PCR来产生第一cDNA扩增子并稀释第一扩增子以及就此进行第二PCR直至所有引物被消耗来产生第二扩增子，从而扩增兴趣RNA。

本发明针对一个相关的方法，其还包括用一个或多个荧光团标记第二PCR引物对。

本发明针对另一个相关的方法，其还包括第二扩增子与具有互补于基因序列兴趣区的序列的探针杂交，从杂交的扩增子中检测荧光图式，并基于荧光图式鉴定一个或多个基因或其等位基因型。本发明还针对另一个相关的方法，其还包括对第二扩增子进行测序用于其分析。