[发明专利]对双链DNA中的目标序列进行扩增的方法

说明书

技术领域

本发明涉及对双链DNA中的目标序列进行扩增的方法。

背景技术

图1所示的聚合酶链反应（以下称作“PCR”）是对由第1单链DNA6和第2单链DNA7构成的双链DNA中所含的目标序列1进行扩增的代表性方法。

以下一边参照图1一边简单地说明PCR法。

第1单链DNA6由3’末端-第1非扩增序列6a-单链目标序列1a-第2非扩增序列6b-5’末端构成。第2单链DNA7由5’末端-第3非扩增序列7a-互补性单链目标序列1b-第4非扩增序列7b-3’末端构成。互补性单链目标序列1b、第3非扩增序列7a和第4非扩增序列7b分别与单链目标序列1a、第1非扩增序列6a和第2非扩增序列6b互补。

首先，将DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、双链DNA1、正向引物4和反向引物5混合，制备混合液。

正向引物4由具有5～20个碱基的核酸构成、且与单链目标序列1a的3’末端部分6c互补。反向引物5由具有5～20个碱基的核酸构成、且与互补性单链目标序列1b’的3’末端部分互补。因此，正向引物4和反向引物5分别结合在3’末端部分6c和3’末端部分7c。

接着，将该混合液在94℃～100℃下从1秒钟开始加热100秒钟，之后在50～70℃下从1秒钟开始冷却100秒钟。反复进行加热和冷却，获得扩增双链DNA序列2。扩增双链DNA序列2由与单链目标序列1a相同的扩增单链目标序列6g和与互补性单链目标序列1b相同的扩增互补性单链目标序列7g构成。

专利文献1~3可以与本发明相关。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平5-199900号公报

专利文献2：日本特表2003-534772号公报

专利文献3：日本特表平3-508636号公报（特别是图3、图12）

发明内容

发明要解决的技术问题

如图1所示，当第1非扩增序列6a含有与单链目标序列1a的3’末端部分6c相同的序列6d时，正向引物4不仅结合在3’末端部分6c、还结合在该序列6d上。当第1非扩增序列6a含有与单链目标序列1a的3’末端部分6c相类似的序列6d时，正向引物4不仅结合在3’末端部分6c、还会错误地结合在该序列6d上。

因此，所得的扩增双链DNA序列不仅包含所期望的扩增双链DNA序列2、还包含不希望的扩增双链DNA序列3。该扩增双链DNA序列3是非特异性扩增的产物，由不希望的扩增单链DNA3a和扩增互补性单链DNA3b构成。

本发明的目的在于提供能够抑制不希望的扩增双链DNA序列3的产生的扩增方法。

用于解决技术问题的手段

解决上述课题的本发明是对由第1单链DNA和第2单链DNA构成的双链DNA中的双链目标序列进行扩增的方法，其中，

所述双链目标序列由单链目标序列（1a）和互补性单链目标序列（1b）构成，

所述第1单链DNA由3’末端-第1非扩增序列（6a）-所述单链目标序列（1a）-第2非扩增序列（6b）-5’末端构成，

所述第2单链DNA由5’末端-第3非扩增序列（7a）-所述互补性单链目标序列（1b）-第4非扩增序列（7b）-3’末端构成，

所述互补性单链目标序列（1b）、第3非扩增序列（7a）和第4非扩增序列（7b）分别与所述单链目标序列（1b）、所述第1非扩增序列（6a）和第2非扩增序列（6b）互补，

所述方法是将DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、所述双链DNA（6、7）、正向引物、反向引物和第1阻碍核酸（20）混合，使用聚合酶链反应对所述双链目标序列进行扩增的工序A，

其中，所述正向引物和所述反向引物均作为用于利用所述DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用，

所述正向引物与所述单链目标序列（1a）所含的3’末端侧的序列的部分互补，

所述反向引物与所述互补性单链目标序列（1b）所含的3’末端侧部分的序列互补，

所述第1阻碍核酸（20）不会作为用于利用所述DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用，

所述第1阻碍核酸（20）与所述第3非扩增序列（7a）的一部分互补。

发明效果

可以抑制不希望的扩增双链DNA序列3的产生。

附图说明

[图1]表示以往PCR的图

[图2]表示本发明的PCR的图

[图3]接图2、表示本发明的PCR的图