[发明专利]DNA微阵列中的探针设计方法、具有利用该方法设计的探针的DNA微阵列

说明书

技术领域

本发明涉及例如设计用于检测基因组DNA中的突变的DNA微阵列中的探针的方法、具有利用该方法设计的探针的DNA微阵列、使用该DNA微阵列的突变检测方法。

背景技术

在以单核苷酸多态性（SNP）为代表的多态性中，有可将同种生物中的变异作为带有特征的突变而利用的多态性。即，同种生物的规定的变异可通过检测、鉴定所谓多态性的基因组DNA中的特定的突变从而与其它突变区别。另外，通过检测、鉴定该突变，从而能指定供试的生物的变异。

作为这种检测基因组DNA中的突变的方法，已知有对突变位置进行直接序列确定的方法，利用限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）的方法，利用扩增片段长度多态性（AFLP）的方法等。另外，已知有利用被称为DArT（Diversity Array Technology）法的DNA微阵列的、基于多态性鉴定的突变的解析方法（Nucleic Acids Research,2001,Vol.29,No.4,e25）。

将DArT法所使用的DNA微阵列的制作方法示于图9。首先，从特定生物种中提取基因组DNA，使用限制性内切酶A和限制性内切酶B将基因组DNA片段化。接着，在由限制性内切酶处理得到的基因组DNA片段的两端部连结接头，将各基因组DNA片段克隆到载体上。然后，使用能与该接头杂交的引物利用PCR扩增各基因组DNA片段。接着，将扩增的各基因组DNA片段作为探针在基板上点样，由此制作DNA微阵列。

使用这样制作的DNA微阵列，可以解析供试生物种的突变。首先，由供试生物提取基因组DNA，使用DNA微阵列制作时利用的限制性内切酶A和限制性内切酶B将基因组DNA片段化。对于片段化的基因组DNA，与DNA微阵列制作时同样地连结接头，通过PCR进行扩增。用荧光标记等将扩增的基因组DNA片段标记化，与在DNA微阵列上点样的探针杂交。检测标记化的基因组DNA片段与探针的杂交的有无，由此能解析DNA微阵列制作时所使用的特定的生物种与所述供试生物种的区别。

发明内容

根据DArT法，通过使用如上所述制作的DNA微阵列，能够在基因组DNA中的基因型水平判定生物种的多样性。但是，在如上所述制作的DNA微阵列中，存在作为被限制性内切酶识别部位夹入的区域而规定的探针的检测能力不充分的问题。即，即使在来自供试生物种的基因组DNA片段中包含例如SNP等细微突变，也有时对DNA微阵列中的探针发生杂交。换言之，DArT法中，存在如果不是在限制性内切酶识别部位存在多态性等突变、或者不是在数百碱基对范围存在缺失时就不能检测的检测极限。

因此，本发明鉴于上述情况，目的在于提供基因组DNA所含有的SNP等多态性的检测效率优异的DNA微阵列中的探针的设计方法、具有利用该方法设计的探针的DNA微阵列以及使用了该DNA微阵列的突变检测方法。

鉴于上述情况，本发明人等进行了认真研究，研究出了即使是基因组DNA中的SNP等的细微突变也能以优异的灵敏度进行检测的探针的设计方法、以及使用了固定有该探针的DNA微阵列的突变检测方法。

本发明包含以下内容。

即，本发明的探针的设计方法，包括：对于来源于对象生物的基因组DNA所含有的、被限制性内切酶识别部位夹入的基因组DNA片段，指定具有比该基因组DNA片段短的碱基长度且覆盖该片段内的至少一部分的1个或多个区域的步骤；将指定的1个或多个区域作为用于检测供试生物中的上述片段的探针来进行设计的步骤。

所述1个或多个区域能够通过以下工序指定。

（1a）提取所述基因组DNA的工序，

（1b）用所述限制性内切酶将提取的基因组DNA消化的工序，

（1c）将接头连结到所述（1b）中得到的基因组DNA片段的工序，

（1d）使用与所述接头杂交的引物将所述基因组DNA片段扩增的工序，

（1e）确定扩增的所述基因组DNA片段的碱基序列的工序，

（1f）基于确定的碱基序列来确定所述1个或多个区域的工序。

在此，在所述（1b）中，可以用多种限制性内切酶消化所述基因组DNA，也可以用单独的限制性内切酶消化所述基因组DNA。另外，在所述（1c）中，作为所述接头，优选使用具有与所述（1b）中得到的基因组DNA片段的突出末端互补序列的接头。另外，在所述（1f）中确定的区域例如是20～10000碱基长度，优选是100～8000碱基长度，更优选是200～6000碱基长度。