[发明专利]弗林蛋白酶敲减和GM-CSF增强的（FANG）癌症疫苗

说明书

技术领域

本发明大体上涉及疫苗开发领域，更具体而言，涉及制备和使用经基因修饰以敲减弗林蛋白酶并表达GM-CSF的自体癌症疫苗的方法和组合物的开发。

发明背景

在不限制本发明范围的前提下，结合基因修饰的全细胞癌症疫苗的开发来描述本发明的背景。更具体而言，本发明涉及能够通过GM-CSF转基因的表达增强肿瘤抗原表达、呈递和处理，以及通过弗林蛋白酶双功能shRNA转基因诱导的敲减来减弱分泌免疫抑制活性的疫苗。

对于癌症疫苗的免疫耐受的流行假说包括肿瘤细胞的低免疫原性，缺乏专职抗原呈递细胞的合适呈递，抗原缺失变异体的免疫选择，肿瘤诱导的免疫抑制，和肿瘤诱导的隔离部位。全癌细胞疫苗可潜在地引起针对明确和不明确的肿瘤抗原的广泛、多价的免疫应答，从而通过下调和/或选择抗原缺失变异体来解决肿瘤耐药性的可能性。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，通常缩写为GM-CSF，为巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞所分泌的蛋白。当整合为细胞因子转基因时，GM-CSF提高癌症疫苗肽，肿瘤细胞裂解物，或来自自体患者肿瘤细胞或确立的异基因肿瘤细胞系的全肿瘤细胞的呈递。GM-CSF诱导造血前体的分化并将其吸引至接种位点。GM-CSF也充当树突细胞成熟和活化过程的佐剂。然而，由肿瘤细胞产生和/或分泌的转化因子β（TGF-β）的不同同工型可抑制GM-CSF介导的免疫致敏。多功能蛋白的TGF-β家族具有众所周知的免疫抑制活性。三种已知的TGF-β配体（TGF-β1、β2和β3）普遍存在于人类癌症中。TGF-β的过表达与肿瘤进展及不良预后相关。肿瘤微环境中TGF-β水平升高与无免疫性的肿瘤反应相关。TGF-β直接和间接抑制GM-CSF诱导的树突细胞的成熟及其表达II类MHC和共刺激分子。TGF-β对GM-CSF介导的免疫活化的负面影响支持在基于GM-CSF的癌细胞疫苗中消耗TGF-β分泌的依据。

所有TGF-β成熟的同工型需要弗林蛋白酶介导的限制性蛋白酶切以获得适当活性。弗林蛋白酶是一种钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，为枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的成员。弗林蛋白酶最为知名的是通过相应的免疫调节分支对TGF-β进行功能活化。除了前述的肿瘤分泌的TGF-β的免疫抑制活性，已发现T淋巴细胞中内源性表达的弗林蛋白酶的条件性缺失允许T细胞正常发育，但损坏调节和效应T细胞的功能，从而产生较少的TGF-β1。T细胞表达的弗林蛋白酶表现为在维持外周耐受中不可缺少，这至少部分由于其在调节TGF-β1产生中具有非重复的必需的功能。

已证明几乎在所有癌细胞系中均有高水平的弗林蛋白酶。发明人和其他人员发现人类结肠直肠癌，肺癌和黑色素瘤细胞产生高达10倍的较高水平的TGF-β1，并可能较高幅度地影响免疫耐受状态。肿瘤细胞中弗林蛋白酶的存在很可能显著有助于维持肿瘤引导的TGF-β介导的外周免疫耐受。因此弗林蛋白酶敲减代表优化GM-CSF介导的免疫致敏的新颖并具吸引力的方法。

干扰素-γ（γIFN）为重要的免疫调节细胞因子，其在宿主固有和适应性免疫应答和肿瘤控制中起关键作用。γIFN也称为II型干扰素，为表达在多个水平上受到调节的单拷贝基因。γIFN通过免疫相关基因的转录调节与各种不同系列的细胞程序相关。最初认为CD4+辅助性T细胞1型（Th1）淋巴细胞，CD8+细胞毒性的淋巴细胞，和NK细胞专有地产生γIFN。然而，现在有证据显示其它细胞，如B细胞，NKT细胞和专职性抗原呈递细胞（APC）分泌γIFN。由局部作用的专职性APC[单核细胞/巨噬细胞，树突细胞（DC）]产生γIFN在细胞自活化及附近细胞的活化中可以是重要的。由NK细胞和可能的专职APC分泌γIFN很可能在针对感染的早期宿主防御中起重要作用，而T淋巴细胞成为适应性免疫应答中γIFN的主要来源。此外，已确定γIFN在预防原发性和移植肿瘤的发展中的作用。γIFN产生受APC分泌的细胞因子控制，尤其是白细胞介素(IL)-12和IL-18。γIFN产生的负调节物包括IL-4、IL-10、糖皮质激素和TGF-β。

发明概述