[发明专利]蛋白质和多肽的制备

说明书

发明的技术领域

本发明涉及制备蛋白质和多肽，且更具体地涉及制备蜘蛛丝蛋白(拖丝蛋白)和其他非拖丝蛋白的蛋白质和多肽的领域。本发明提供了制备期望的蛋白质的方法，该期望的蛋白质可以是拖丝蛋白的蛋白质/多肽或非拖丝蛋白的蛋白质/多肽。还提供了用于制备期望的蛋白质和多肽的新型融合蛋白中间体以及编码这些中间体的多核酸(polynucleic acid)分子。

发明背景

由DNA制备蛋白质和多肽可在多种宿主中实现，但常见的问题是不溶性蛋白质/多肽聚集体的形成。这可严重地妨碍或甚至阻止功能性蛋白质/多肽的产生。针对该问题的一个解决方案是将期望的蛋白质或多肽与提供所需要的溶解度的蛋白质或多肽表达成融合蛋白。该融合蛋白可被裂解，从而分离期望的蛋白质。

对于低溶解度蛋白质和多肽例如膜相关蛋白质和多肽，该问题通常加重。例如，肺表面活性蛋白C(SP-C；表6)是由肺泡II型细胞产生的跨膜蛋白并且是防止肺泡在呼气结束时萎陷所需要的表面活性物质的成分。新生儿经常因表面活性物质的量不足而患呼吸窘迫。如今，用从动物的肺部提取的表面活性物质制剂治疗该病症。SP-C-33是SP-C的变体，其中跨膜螺旋中的残基(通常主要是缬氨酸)被换成亮氨酸。SP-C-33保留了天然SP-C的功能，包括在膜中的适当插入，但是不太易于聚集且因此大量生产用于开发合成的表面活性物质制剂是可行的。因为迄今为止由DNA制备SP-C-33是不可能的，所以如今通过化学合成来制造。

当由重组DNA表达时遇到困难的蛋白质和多肽的其他实例是Aβ-肽、IAPP、PrP、α-突触核蛋白、降钙素、催乳素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、ATF和肌动蛋白；SP-B、α-防卫素和β-防卫素；A-H类载脂蛋白；LL-37、SP-C、SP-C33Leu、Brichos、GFP、神经丝抑蛋白；激素，包括EPO和GH，及生长因子包括IGF-I和IGF-II；亲和素和链霉亲和素；和蛋白酶3C。

发明概述

本发明的目的是提供用于制备蛋白质和多肽，且特别是非拖丝蛋白的蛋白质和多肽的新型手段和方法。

提供用于制备在水中具有低的溶解度的蛋白质和多肽，且特别是非拖丝蛋白的蛋白质和多肽，例如当由重组DNA产生时易于聚集的蛋白质和多肽、膜蛋白和多肽及淀粉样形态(amyloid-forming)的蛋白质和多肽的新型手段和方法也是本发明的目的。

本发明的另一个目的是提供用于制备蛋白质或多肽药物及药靶的替代手段和方法。

本发明的目的是提供用于制备含二硫键的蛋白质和多肽的新型手段和方法。

提供用于制备载脂蛋白的新型手段和方法也是本发明的目的。

为了这些目的和从以下说明书中将明显的其他目的，本发明提供了根据第一方面的在生产期望的蛋白质或多肽的方法中有用的融合蛋白。融合蛋白本身可能是有用的，或其可被裂解以获得分离形式的期望的蛋白质或多肽。根据本发明的融合蛋白包含(i)衍生自蜘蛛丝蛋白的N端(NT)片段的至少一个溶解度增强部分；和(ii)是期望的蛋白质或多肽的至少一个部分；其中每个溶解度增强部分与期望的蛋白质或多肽部分直接或间接连接。

在融合蛋白的某些实施方式中，每个溶解度增强部分与SEQ ID NO 6具有至少80％的同一性或与SEQ ID NO 8具有至少50％的同一性。在融合蛋白的特定实施方式中，每个溶解度增强部分包含100至160个氨基酸残基。

在一个实施方式中，融合蛋白受制于如下条件：当融合蛋白包含衍生自蜘蛛丝蛋白的N端(NT)片段的单一溶解度增强部分时，则期望的蛋白质或多肽是非拖丝蛋白的蛋白质或多肽。

在优选的实施方式中，期望的蛋白质或多肽是非拖丝蛋白的蛋白质或多肽。在一些实施方式中，期望的蛋白质或多肽与SEQ ID NO：6-10中的任何一个具有小于30％的同一性。

在某些实施方式中，融合蛋白包含至少两个溶解度增强部分，所述溶解度增强部分的每一个衍生自蜘蛛丝蛋白的N端(NT)片段。在特定实施方式中，融合蛋白包含至少两个连续的溶解度增强部分，所述溶解度增强部分的每一个衍生自蜘蛛丝蛋白的N端(NT)片段。